M-O7e细胞凋亡前后eIF-5A差异表达的鉴定及重组人eIF-5A蛋白的分离纯化和结构鉴定

摘要

真核生物起始因子5A（eIF-5A）是真核细胞内的一种翻译起始因子,是含量最多的起始因子之一,在所有真核细胞内普遍存在,分子量为18kD,从酵母到哺乳动物细胞都高度保守,在细胞生长和分化中起作用,也与细胞增殖有关.近期的研究表明,eIF-5A在肿瘤细胞内高表达,并在HIV-1感染的细胞中作为Rev蛋白（反式激活蛋白）的一个,同时也是Rex蛋白（属于人T细胞白血病I型病毒HTLV-1）的辅因子,而Rev和Rex是病毒复制所必须的,它们作为穿梭蛋白介导病毒未剪切mRNA的核外转运,因此eIF-5A可能也参与了mRNA的核外转运系统.此外,eIF-5A还是参与细胞凋亡的蛋白tTGase的底物,tTGase是一种谷氨酰氨转移酶,可调控细胞凋亡和肿瘤细胞增殖.基于其内在的生化特点,目前eIF-5A被认为是增强肿瘤细胞凋亡综合策略中的一个潜在靶标.另外,已有研究表明,eIF-5A的修饰突变体可以抑制感染HIV-1的T细胞中HIV-1的增殖,因此在AIDS治疗中有重要意义;我们已有的工作也表明eIF-5A是对阻断泛素蛋白酶体通路（简称UP通路）敏感的白血病细胞系M-O7e中的效应分子.该课题的目的是从eIF-5A阳性菌株中分离重组人eIF-5A,纯化后进行一级结构鉴定,为高级结构分析、新药靶标研究和制备抗体做准备.

目录

英文缩略词

前 言

第一部分M-07e细胞凋亡前后eIF-5A差异表达的鉴定

一、引言

二、实验部分

1仪器和试剂

2实验方法

三结果与讨论

1 M-07e细胞及抑制剂作用后的蛋白质组图谱

2 M-07e细胞诱导凋亡后T点的差异表达

3胶内蛋白质的原位酶切

4肽质量指纹谱鉴定T点

5手工酶切与自动酶切的比较结果

四小结

第二部分重组人eIF-5A蛋白的诱导表达和分离纯化

一技术路线

二实验部分

1仪器、材料与试剂

2实验方法

三结果与讨论

1菌株选取

2诱导条件的优化

3钴柱亲合纯化

4反相色谱纯化

5纯度分析

四小结

第三部分重组人eIF-5A蛋白的结构鉴定

一引言

二实验部分

1仪器和试剂

2实验方法

三结果与讨论

1分子量测定

2 N-端部分序列测定

3肽质量指纹谱测定

4肽段序列测定

四小结

总 结

参考文献

致 谢

文献综述