日本沼虾(Macrobrachium nipponense)卵黄蛋白原代谢相关基因的克隆和表达研究

摘要

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)又名青虾、河虾,是我国重要的经济淡水虾。近年来,随着其自然资源的锐减和养殖规模的扩大,养殖的日本沼虾出现了生产性能下降和种质资源退化的情况,其中虾个体小型化和“性早熟”的现象尤为突出。“性早熟”即雌、雄性个体性腺提前发育,造成了商品虾的规格降低,繁殖性能下降,严重影响了日本沼虾的品质和产值,成为日本沼虾养殖业发展的一大瓶颈。与精巢相比,卵巢发育需要消耗更多的营养,使得雌性个体的“性早熟”对日本沼虾的养殖业产生的负面影响更大。造成雌性个体“性早熟”的因为尚未完全查明,有学者从养殖外部环境条件和营养调控的角度进行了探讨,但均未涉及到卵巢发育提前启动,即雌性“性早熟”的机理,查明虾的卵巢发育机制将为解决这一生产难题提供理论基础参考。
　　 甲壳动物卵巢发育过程中最显著的变化是卵母细胞直径的剧烈增大,这主要是由于卵巢内卵黄蛋白(yolk protein)等营养物质大量积累所致。甲壳动物卵黄蛋白的前体物质卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)在卵子发育之初即启动合成,合成后在体内被水解为卵黄蛋白沉积在卵母细胞中。有关甲壳动物Vg的合成和水解过程的影响和调控机制至今不十分清楚,但卵生脊椎动物这一过程的研究已做了大量细致的工作。卵生脊椎动物Vg的合成受体内外多种激素和多肽的调控,其中热休克蛋白90(heat shock protein90,HSP90)和环境类雌激素双酚A(BPA)和雌激素受体结合,诱导体内Vg合成,Vg合成后在水解酶的作用下水解为卵黄蛋白,组蛋白酶L(canthepsin L,CL)和组蛋白酶B(Canthepsin B,CB)在这一水解过程中发挥着重要的作用。
　　 本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次克隆获得日本沼虾Vg基因cDNA片段、HSP90、CL和CB基因cDNA全长,分别命名为MnVg、MnHSP90、MnCL和MnCB。并测定了上述基因在日本沼虾不同组织中、卵巢发育过程中及不同剂量BPA浸泡暴露下mRNA表达量的变化。研究结果将为阐明日本沼虾“性早熟”的产生过程,以及采取有效的控制手段提供必要的参考。
　　 主要研究结果如下:
　　 1、克隆获得567bp的日本沼虾MnVg片段,该序列共编码183个氨基酸；这183个氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Vg蛋白的相似性高达95％,与朝鲜长额虾(Pandalus hypsinotus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)、刀额新对虾(Penaeus monodon)Vg蛋白的相似性分别为76％、52％、52％、51％；不同组织实时荧光定量PCR(qPCR)结果显示:MnVg mRNA在日本沼虾鳃、肌肉、血细胞、心脏、胸神经节和肠中均有表达,胸神经节中的表达量最高；卵巢和肝胰腺中Vg表达量随着卵巢的发育逐步升高,当卵巢发育至次级卵黄发生期(Ⅳ期)时MnVg的表达量达到最大值,而且在卵巢发育过程中肝胰腺内MnVg的表达量显著高于卵巢内的表达量(p<0.05)。上述结果表明:日本沼虾MnVg合成既有内源性又有外源性,且以外源性的合成为主,肝胰腺是日本沼虾MnVg的主要合成器官。
　　 2、动物受到外界刺激,如热刺激等,体内HSP90会大量合成,但是近年来的研究结果表明,HSP90不仅与热休克等刺激有关,而且在卵生脊椎动物的卵巢发育过程中也具有重要的作用。雌二醇缺乏时,HSP90和雌二醇受体结合,从而促进Vg蛋白合成。本研究应用简并引物通过RACE法成功克隆了日本沼虾MnHSP90基因cDNA全长序列。该序列全长2,684 bp,其中包括126 bp5’-UTR,2,199 bp ORF和359 bp3’-UTR(序列号:GU319963),ORF编码732个氨基酸,该蛋白的分子量为84.3KDa。序列比对结果显示MnHSP90氨基酸序列与其它动物HSP90氨基酸序列具有很高的相似性(72％-79％)。qPCR测定结果显示,MnHSP90基因在日本沼虾胸神经节中表达量最高,显著高于其它组织(肌肉、肠、鳃和血细胞)(p<0.05),为其他组织的2-10倍；不同组织中,肌肉、肠、鳃中的表达量均较高,显著高于雌虾和雄虾血细胞中的表达量(p<0.05)。卵巢和肝胰腺中的MnHSP90表达量随着卵巢发育逐步升高,分别在初级卵黄发生期(Ⅲ期)和次级卵黄发生期(Ⅳ期)达到最大值。在卵巢整个发育过程中,肝胰腺中的MnHSP90表达量显著高于卵巢(p<0.05)。上述结果不仅表明MnHSP90与日本沼虾的卵巢发育有关,而且进一步证明了肝胰腺是日本沼虾卵黄蛋白原主要的合成器官,同时表明胸神经节在日本沼虾卵巢发育过程中发挥着重要的作用。
　　 3、在日本沼虾的BPA安全浓度(12.06mg/L)上下范围内,采用等对数的方法设定了5个暴露浓度组:5.01mg/L、7.76mg/L、12.056mg/L、18.62mg/L和28.84mg/L,将日本沼虾分别浸泡暴露于上述浓度的BPA中,19d后测定其卵巢中MnVg和MnHSP90表达量的变化。测定结果显示MnVg和MnHSP90基因的表达量随着BPA浓度的上升,先增加后降低,12.06 mg/L组MnVg和MnHSP90基因的表达量最高。即低浓度的BPA促进日本沼虾卵巢MnVg和MnHSP90基因的表达,高浓度则抑制日本沼虾卵巢MnVg和MnHSP90基因的表达。
　　 4、为了研究日本沼虾卵黄蛋白原的水解过程,本研究在日本沼虾卵巢EST序列的基础上,通过RACE法成功克隆了日本沼虾MnCL和MnCB基因全长cDNA序列。
　　 序列分析结果表明,MnCL序列含有31 bp的5’-UTR,1029 bp的ORF和650 bp的3'-UTR(序列号:HM134078)。ORF共编码342个氨基酸,此多肽N端具有18个氨基酸的信号肽和61个氨基酸的前导肽,成熟肽具有253个氨基酸,理论pI为5.25,分子量为37.7KDa。MnCL蛋白与斑节对虾(Penaeus monodon)、黄粉虫(Tenebrio molitor)和玉米象(Sitophiluszeamais)CL蛋白相似性分别为73％、66％和66％。MnCL在测定的各组织(胸神经节、心脏、鳃、肠)中的表达量均较高,显著高于雌虾血细胞中的表达量(P<0.05)。在测定的各组织中,心脏和肌肉中表达量最高,显著高于其它组织(P<0.05)。在卵巢的发育过程中,肝胰腺中MnCLmRNA的表达量始终高于卵巢。卵巢中的MnCLmRNA的表达量随着卵巢的发育逐步升高,当卵巢发育至次级卵黄发生期(Ⅳ期)时,表达量达到最大值。肝胰腺中的MnCLmRNA表达量在卵黄发生前期(Ⅱ期)和次级卵黄发生期(Ⅳ期)时表达量较高,其中卵黄发生前期(Ⅱ期)表达量最高。
　　 序列分析结果表明,MnCB序列含有12 bp的5’-UTR,996 bp的ORF和702 bp的3'-UTR(序列号:HM134079)。ORF共编码331个氨基酸,此多肽N端含有16个氨基酸的信号肽和40个氨基酸的前导肽,成熟肽具有247个氨基酸组成,理论pI为6.36,分子量为36.5KDa。MnCB蛋白与斑节对虾(P.monodon)、埃及斑蚊(Aedesaegypti)和玉米根叶甲(Diabrotica virgifer)CB蛋白相似性分别为84％、65％和64％。MnCB基因在心脏中表达量最高,肌肉、肝胰腺和胸神经节中表达量次之,肠、鳃和血细胞中的表达量较低。MnCB的表达量在卵巢的发育过程中逐步升高,卵巢发育至初级卵黄发生期(Ⅲ期)MnCB的表达量显著增加,次级卵黄发生期(Ⅳ期)表达量继续增加,但是与初级卵黄发生期(Ⅲ期)表达量相比差异不显著(p>0.05)。
　　 综上所述,日本沼虾MnVg主要在肝胰腺中合成,在卵巢发育过程中MnVg合成量逐步升高,当卵巢发育至次级卵黄蛋白发生期(Ⅳ期)MnVg合成达到最大值；MnHSP90和BPA对MnVg的合成具有一定的协同促进作用；提示MnCL和MnCB与日本沼虾卵巢发育有关,其作用途径可能是通过参与MnVg的水解过程而发挥作用。

目录

文摘

英文文摘

博士学位论文答辩委员会成员名单

第一章 文献综述

1 卵黄蛋白原(Vg)的性质及热休克蛋白90(HSP90)对其合成调控中的影响

2 卵黄蛋白原(Vg)水解过程的研究进展

3 本论文的研究目的、意义和技术路线

第二章 日本沼虾卵黄蛋白原(MnVg)基因的克隆及其在卵巢发育过程中的时空表达分析

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三章 日本沼虾热休克蛋白90(MnHSP90)基因的克隆及其在MnVg合成过程中的作用

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第四章 双酚A(BPA)对日本沼虾卵巢MnVg和MnHSP90表达量的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第五章 日本沼虾组蛋白酶L(MnCL)和组蛋白酶B(MnCB)基因的克隆及其在MnVg水解过程中的作用

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

结语

参考文献

缩略语表

附录

致谢