分泌涩柿单宁酶的微生物筛选及其酶特性的研究

摘要

柿(Diospyros kaki Lf．)是一种营养成分丰富的水果。含有糖类、人体必须的氨基酸、多种微量元素、维生素、有机酸、黄酮类等。我国柿资源丰富，栽培面积达293.8公顷，年总产量为3469.4千吨，占世界总产量的70％以上。我国生产的柿约有80％是涩柿，脱涩后柿果在加工过程中或加工后出现的返涩现象，至今在生产实践中仍没有科学、有效的解决方法，严重制约了涩柿加工的工业化生产和产业化发展。传统的脱涩方法涩柿脱涩后并非单宁物质消失，只是因为单宁溶解度降低，与口腔中蛋白质的结合能力降低，人感觉不到涩味。本论文以解决涩柿返涩问题为出发点，寻找可以分泌单宁酶的微生物，分解涩柿单宁，从根本上解决涩柿返涩问题。这对推动柿产业发展、增加柿果的附加值，提高经济效益有重要的实践指导意义。 本文从创造模拟环境入手，以涩柿作为微生物生长的微环境，让微生物自然生长，利用平板划线法分离微生物，获得纯种菌株。通过菌株在溴酚兰培养基中的变色情况、COD去除率以及菌株对单宁耐受力，筛选出目标菌株。通过对菌落形态观察和水浸片的观察，初步鉴定目标菌株为黑曲霉(A.niger)。 对目标菌株的原生质体进行紫外诱变，测定诱变菌株产酶能力及传代稳定性，筛选出试验菌株。通过单因素试验和L<,27>(3<'13>)正交试验，研究了培养时间、温度、初始pH值、葡萄糖浓度、接种量、涩柿单宁含量、容器装液量等因素，确定该诱变菌株产酶的最优工艺参数。最后对黑曲霉单宁酶的特性进行探讨。研究结果如下： (1)28℃，160r/min摇床中，黑曲霉恒温培养72h可获得较大生物量和最高产酶能力。 (2)160r/min摇床中恒温培养72h，黑曲霉产酶的适宜温度为28～32℃，其中30℃时黑曲霉所产单宁酶活力最高为142.9U/mL。 (3)30℃，160r/min摇床中恒温培养72h，黑曲霉产单宁酶的适宜涩柿单宁浓度为2～5％。涩柿单宁浓度为4％时，可获得最大酶活156.7U/mL。 (4)30℃，160r/min摇床中恒温培养72h，黑曲霉生在pH值为5～7的条件下生长较好，其所分泌单宁酶活力较高，pH值为5时，黑曲霉生物量最大，为356.8mg；pH值为6时，单宁酶活力最高，为160.3U/mL。 (5)30℃，160r/min摇床中恒温培养72h，发酵液中葡萄糖浓度为0.5～1.0％时，黑曲霉发酵产单宁酶能力较高，葡萄糖浓度为0.8％黑曲霉产酶能力最高。 (6)30℃，160r/min摇床中恒温培养72h，接种量为1.5％～2.5％时，黑曲霉所产酶能力较高；接种量为2％时，黑曲霉产酶能力最高。 (7)30℃，160r/min摇床中恒温培养72h，250mL容量瓶中装液量为40～60 mL适宜黑曲霉发酵产生单宁酶，装液量为50mL时黑曲霉所分泌单宁酶活力最高。 (8)正交试验得出，各因素及其交互作用对试验指标影响的主→次顺序为：培养时间，培养温度，发酵液量，单宁含量，葡萄糖含量，发酵液初始pH值，接种量；黑曲霉发酵产单宁酶最优组合为培养时间72h，培养温度28℃，发酵液量40mL，涩柿单宁含量3％，葡萄糖含量0.8％，发酵液初始pH值7.0，接种量2.5％。 (9)动力学研究表明，以PG为底物时，米氏方程Km=0.595mmol/L，Vm=0.363mol/L·min。 (10)黑曲霉单宁酶催化分解涩柿单宁的适宜pH值范围为4.0～6.0，最适pH值为5.0；单宁酶在pH值为5～7的体系中活性较为稳定。 (11)单宁酶作用的适宜温度为50～60℃，最适反应温度为55℃；单宁酶活性稳定的温度范围为≤60℃。 (12)K<'+>、Mn<'2+>对单宁酶活力无抑制作用，Ca<'2+>影响较小，Mg<'2+>可使单宁酶活力降低，Cu<'2+>、Zn<'2+>、Fe<'2+>、Al<'3+>，Co<'2+>对单宁酶均有显著抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1柿概述

1.1柿及柿树概述

1.2涩柿主要营养成分和医疗保健功能

2柿单宁

2.1单宁及其性质

2.2柿果单宁细胞、单宁分子结构的研究

2.3传统涩柿脱涩方法

3微生物单宁酶

3.1微生物单宁酶的研究概况

3.2单宁酶的应用

4本论文目标

1引言

2试验材料与设备

2.1试验材料与试剂

2.1.1试验原料

2.1.2主要试验试剂

2.1.3试剂的配制

2.1.4培养基的制备

2.2主要仪器与设备

3试验方法

3.1单宁的提取和测定

3.1.1涩柿单宁提取

3.1.2粗单宁单宁含量的测定

3.2野生菌株获得

3.2.1菌种分离与纯化

3.2.2菌种的初筛

3.2.3菌种复筛

3.2.4 COD值的测定方法

3.3菌株的鉴定

3.4单宁酶提取

3.4.1黑曲霉的液态培养

3.4.2单宁酶粗酶液的提取

3.5单宁酶活力测定

3.5.1没食子酸丙酯(PG)标准曲线的绘制

3.5.2单宁酶活力测定

3.6产酶菌株的诱变选育

3.6.1原生质体的制备

3.6.2原生质体的紫外诱变

3.6.3原生质体再生

3.6.4高产酶诱变菌株的筛选

3.6.5高产酶菌株产酶稳定性

3.7单宁酶发酵条件的单因素试验

3.7.1发酵时间对诱变后黑曲霉生长和产酶的影响

3.7.2温度对黑曲霉产酶的影响

3.7.3涩柿单宁浓度对发酵产酶的影响

3.7.4初始pH对黑曲霉发酵产酶的影响

3.7.5发酵液葡萄糖浓度对发酵产酶的影响

3.7.6接种量对发酵产酶的的影响

3.7.7装液量对发酵产酶的影响

3.8单宁酶发酵条件正交试验

3.9单宁酶反应进程曲线

3.10 PG浓度对酶活力的影响及单宁酶米氏方程确定

3.11 pH值对单宁酶活力的影响

3.11.1单宁酶的最适pH值

3.11.2单宁酶酸碱稳定性

3.12温度对单宁酶活力的影响

3.12.1单宁酶最适反应温度

3.12.2单宁酶热稳定性研究

3.13金属离子对单宁酶活性的影响

4结果与讨论

4.1单宁含量的测定

4.2野生菌株获得

4.2.1菌种分离与纯化

4.2.2菌株的初筛

4.2.3菌株复筛

4.3菌株的鉴定

4.4单宁酶活力测定

4.4.1没食子酸丙酯标准曲线

4.4.2单宁酶活力的计算

4.5诱变菌株筛选

4.5.1诱变菌株的初步筛选

4.5.2诱变菌株产酶能力的测定

4.5.3诱变菌株产酶稳定性

4.6单宁酶发酵条件的单因素试验结果与分析

4.6.1发酵时间对黑曲霉生长和产酶影响

4.6.2温度对黑曲霉产酶影响

4.6.3涩柿单宁浓度对发酵产酶的影响

4.6.4初始pH值对发酵产酶的影响

4.6.5葡萄糖含量对发酵产酶的影响

4.6.6接种量对发酵产酶的影响

4.6.7装液量对发酵产酶的影响

4.7黑曲霉产酶条件优化的正交试验

4.8单宁酶的反应进程曲线

4.9 PG浓度对单宁酶活性的影响及单宁酶米氏方程的确定

4.9.1底物浓度对酶活性的影响

4.9.2 Km值和Vm值的确定

4.10单宁酶的最适pH值和酸碱稳定性

4.10.1单宁酶最适pH值

4.10.2单宁酶的酸碱稳定性

4.11温度对单宁酶活力的影响

4.11.1单宁酶最适反应温度

4.11.2单宁酶热稳定性研究

4.12金属离子对单宁酶活性的影响

5讨论

5.1单宁检测方法的构建

5.2影响黑曲霉发酵产酶的因素

5.3底物浓度对单宁酶活力的影响

5.4不同反应条件对单宁酶活力的影响

6结论

参考文献

致谢

攻读学位期间研究成果