GADD45基因表达作为生物剂量计的可行性研究

摘要

为了研究GADD45基因在转录水平表达变化和受照剂量之间的关系,该实验选取健康人外周血单个核细胞为实验对象,应用逆转录半定量PCR的实验方法,测定该基因mRNA的相对量.首先根据文献选择特异性引物,在genbank上进行核实,扩增GADD45基因片段.选择在人体内稳定表达的β-actin为内参,合成引物序列并与GADD45进行同管扩增,产物电泳后在凝胶成像仪上用PCR分析软件分析条带的灰度及密度等因素,两者比值(GADD45/β-actin)表示GADD45基因的相对量.将100ml健康献血员外周血平均置于6个40ml培养瓶中,分别给予0、1、2、3、4、5Gy X射线照射,提取单个核细胞,加入含10﹪胎牛血清的1640液后置于37℃培养箱中培养,在培养0h、4h、8h、16h、20h和24h的6个时间点测定GADD45基因的含量.实验采用6×6析因设计,每交叉点重复测量4次,实验结果(基因mRNA相对量)用平均数±标准差表示,用SARS软件分析数据,比较照射后不同时间点之间、不同照射剂量之间、以及不同照射剂量的各个时间点之间是否有统计学差异;作照射后各时间点GADD45表达量与照射剂量的直线相关分析;作不同照射剂量下GADD45表达量与照射后时间的非线性曲线拟合.实验结果显示,照射后各个时间点上GADD45基因表达量间有统计学差异(P<0.05).观察照射剂量与基因表达量的关系可看出,在所观察的各时间点上,基因表达量随照射剂量增加而增加,存在直线关系,得出直线回归方程.观察每个剂量组的基因表达量和时程之间的关系,得出1-5Gy的5个剂量趋势一致:照射后基因表达增加,在照后4小时GADD45基因相对量达最高峰,此后下降,在观察到的最长时间点上(24h)该基因量仍未降至初始水平.该次实验结果表明,X线照射可诱导GADD45基因表达照射随剂量增加而增加,具有较好的线性关系.这与国内外关于X线照射诱导G1期阻滞及相应基因表达变化的实验结果一致,也再次证明了作为P53下游基因的GADD45基因在辐射诱导的细胞G1期阻滞中所起的重要作用.因此我们得出初步结论:GADD45基因可以作为一个新的电离辐射生物标志,该实验中建立的RT-PCR检测技术快速、简便,有希望成为一个新的生物剂量测定方法.

目录

英文缩略词

摘要

Abstract

前言

一、实验材料

二、实验步骤和方法

三、实验结果

四、讨论

五、总结

参考文献

文献综述

致谢