绿色木霉α-1，2-甘露糖苷酶在毕赤酵母中的克隆表达与活性检定

摘要

毕赤酵母是现在广泛应用的、重要的外源基因表达宿主.该研究是我室毕赤酵母工程菌糖基化功能改造工作的起始部分,目的是通过引入绿色木霉的α-1,2-甘露糖苷酶以削减酵母宿主表达外源糖蛋白N-糖链甘露糖苷数目.采用Trizol试剂法从绿色木霉中提取了总RNA,用RT-PCR法从总RNA中扩增出α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)的cDNA序列,即mds基因.将mds基因第944位G突变成A,以除去自身XhoI位点,加上内质网定位标签HDEL序列将该基因克隆至酵母表达载体pPIC9,构建成pPIC9-α-M.将pPIC9-α-M中的BamHI位点消除后,再把连着α-交配因子前导肽序列的mds切下来,连接到经同样酶切的pAO815载体上,构建成pAO815-α-M重组质粒.选取第80位氨基酸仅有一个N-糖基化位点的人β-IFN作为报告蛋白.以含有该蛋白基因的pUC19-B质粒为模版扩增出β-IFN基因,酶切后连接到pAO815-α-中,构建成pAO815-α-B重组质粒.将pAO815-α-B经BamHI和BgⅢ双切后,释放出α-交配因子前导肽序列和β-IFN基因,连接到经BamHI单切的pAO815-α-M载体上,构建成表达MnsI和β-IFN的载体pAO815-α-B-M.将pAO815-α-B和pAO-α-B-M分别转化酵线宿主GS115,得到单儿表达β-IFN和表达β-IFN与MnsI的毕赤酵母工程菌,前者命名为PPMB1,后者为PPMG1.分别培养诱导两种工程菌,SDS-PAGE分析表明两者中β-IFN均得到表达,且两种β-IFN分子量上可见差异.细胞活性测定实验表明PPMB1菌中β-IFN活性为3.6×10<'7>U/ml, PPMG1中β-IFN为1.7×10<'5>U/ml.采用从凝胶中直接切取蛋白条带回收的方法从胶中获取PPMB1和PPMG1表达的β-IFN,经飞行质谱分别检测其分子量.通过绿色木霉α-1,2-甘露糖苷酶在毕赤酵母中对报告蛋白β-IFN分子量产生的影响推测甘露糖残基变化数目.结果表明绿色木霉α-1,2-甘露糖苷酶在毕赤酵母中有活性显示.

目录

缩略词表

第一章引言

第二章材料与方法

2实验材料

2.1菌株与质粒

2.2细胞及病毒

2.3工具酶

2.4核酸及蛋白分子量标准

2.5主要仪器

2.6主要溶液与培养基

第三章实验方法与步骤

3.1引物的设计

3.2绿色木霉mds基因的钓取

3.3表达载体的构建

3.4毕赤酵母工程菌的转化与培养诱导

3.5 PPMG1酵母工程菌中mds基因整合的证明

3.6 PPMG1酵母工程菌中mds基因转录的证明

3.7报告蛋白人β-IFN的细胞活性检测

3.8报告蛋白人β-IFN的SDS-PAGE电泳分析及回收

3.9报告蛋白人β-IFN分子量的飞行质谱检测

第四章实验结果

4.1基因的钓取

4.2表达载体的构建与酶切鉴定

4.3毕赤酵母工程菌的转化与培养诱导

4.4表达B-IFN与MNSI的工程菌PPMG1K中mds基因整合的证明

4.5 PPMG1酵母工程菌中mds基因转录的证明

4.6β-IFN的细胞活性检测

4.7报告蛋白人β-IFN的SDS-PAGE电泳分析及回收

4.8β-IFN分子量的飞行质谱检测

第五章讨论

第六章研究结果小结

参考文献

致谢

综述：酵母N-糖基工程研究进展