梭曼水解酶的分离纯化及其活性位点部分序列研究

摘要

人肝梭曼水解酶的研究中文摘要有机磷化合物水解酶是广泛存在于多种生物体内的一类酯酶，动物实验表明肝脏中含有丰富的有机磷化合物水解酶活性，它对有机磷化合物的高效水解作用已引起人们的极大的兴趣。本课题选择人肝为材料，对人肝中的梭曼水解酶的测定方法、生化性质、序列同源性等进行了研究，主要结果如下： 建立了人肝梭曼水解酶的氟电极测定方法：人肝梭曼水解酶可催化梭曼水解，梭曼水解后释放出游离氟离子(F-)，氟离子电极可直接测得F-浓度，在毫伏计上以电势值显示，因而可以测量酶的催化活性。 依次用超速离心、中空纤维超滤法(30KD,150KD)、制备性平板等电聚焦、SephadexG-50柱、SephadexG-75柱、DEAE-SepharoseCL6B连续性梯度层析、Sephacryl-200HR柱层析等步骤对人肝梭曼水解酶的进行了纯化。SDS-PAGE电泳鉴定显示为单一条带。人肝梭曼水解酶被纯化213倍，比活力达到1070nmolsoman/min/mgprotein。 纯化的人肝梭曼水解酶的生化性质研究表明其分子量为36kD(SDS-PAGE)；氨基酸组份分析发现人肝中梭曼水解酶是含碱性氨基酸较多的一种蛋白。通过肽指纹图谱信息在数据库检索、电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)与HPLC联用获得了准确性很高的三个肽段序列，其提供的氨基酸信息经数据库检索鉴定结果都表明是一种未知蛋白。 纯化的人梭曼水解酶的三个肽段写不同种属梭曼水解酶进行多序列比较，发现梭曼水解酶与鱿鱼型的DFP酶之间具有很高的序列相似性。BLAST检索结果表明人梭曼水解酶的一级结构与钙调蛋白有一定相似性；Swiss-Protsite位点检索结果进一步表明位于第二肽段的DGDGDGYLSAAELR序列是钙结合位点，这段序列与Squid-TypeDFPase保守序列具有相似性，且位于第二肽段的DGDGDGDGY序列也是酪氨酸激酶磷酸化位点，计算机模拟二者的空间结构也具有很高的相似性，位于第三肽段GTLTTK的序列是酰基化位点。 根据我们得到的部分序列与Squid-typeDFPase序列的比较以及报道的Squid-typeDFPase的活性位点，我们提出人的梭曼水解酶的催化机制可能如下： 1.底物梭曼进入梭曼水解酶活性位点中，磷酰基的氧(=O)吸引Ca2+并与之结合，使磷原子的正电性增强，以利于水分子的羟基对磷酰基亲核攻击。 2.组氨酸的咪唑环吸引质子使水分子活化，形成的羟基进行亲核攻击并与磷原子结合。 3.在水分子进攻方向的对侧，氟离子被释放，底物从钙离子上除去。组氨酸去质子化，反应进入下一轮循环。

目录

中英文缩略语表

第一部分人肝梭曼水解酶的活性测定方法的建立

一.实验材料

二.方法和结果

四.讨论

第二部分人肝梭曼水解酶的分离纯化

一.实验材料

二.方法与结果

三、讨论

第三部分纯化的人肝梭曼水解酶的生化性质

一.实验材料

二.方法与结果：

三.讨论

第四部分.梭曼水解酶的活性位点预测及计算机检索

一.材料：

二.方法与结果：

三.讨论：

参考文献：

致谢

文献综述G类有机磷毒剂水解酶的研究进展