立枯丝核菌第45家族糖苷水解酶PAMP活性区段及位点的研究

摘要

玉米在我国国民经济和农业生产中发挥着重要的作用，在我国粮食和饲料作物及工业原料方面占有举足轻重的地位。玉米纹枯病已成为生产中的主要病害，随着高密度栽培和高氮的推广应用，该病害快速蔓延，在全国各地不同玉米产区产生不同程度的减产，严重影响我国农业生产的产量和质量。
　　植物细胞壁是抵抗外界病原物入侵的天然屏障。植物病原真菌和细菌都能产生细胞壁降解酶，成为在植物细胞内和细胞之间蔓延的主要致病因子，如纤维素酶和果胶酶等。近年来，人们越来越注意到在真菌与植物互作机制方面起作用的细胞壁降解酶。PAMP分子是病原微生物表面存在的一些保守分子，广泛存在于微生物中。植物模式识别受体通过识别病原物模式分子来激活体内信号途径，诱导防卫反应从而限制病原物的入侵。
　　前期研究发现，R. solani AG-1-IA融合群中具有PAMP活性的酶中有β-1,4-内切纤维素酶EG1，EG1是一个PAMP分子，并且有研究证明了PAMP活性与催化活性相互独立。为了进一步确定其发挥作用的区段及具体位点，我们通过一系列实验来探究。
　　我们将EG1的野生型命名为WT，通过基因定点突变将EG1氨基酸序列第32位的天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）突变为丙氨酸（Alanine，Ala），导致其催化活性的丧失并命名为D32A。为了确定EG1发挥PAMP活性的区段，我们对EG1的六个相对保守的区段进行了突变，结果发现野生型WT突变区段C6后仍然具有较高的催化活力，能够引起玉米、烟草等植物的叶片坏死，但是不能诱导PAL、POD等防卫反应基因的过量表达；D32A突变区段C6后几乎没有催化活性，既不能引起玉米、烟草等植物的叶片坏死，也不能诱导PAL、POD等防卫反应基因的过量表达。然后利用PVX表达系统进行实验。首先利用PCR扩增法将信号肽序列插入基因5’末端，然后将片段插入pGR106空载体构建PVX表达载体，而后经过冻融法转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） GV3101感受态细胞。将携带重组质粒的农杆菌接种烟草叶片，以转化空pGR106载体的农杆菌作为对照（CK），结果发现WT-C6可以使烟草叶片产生病斑，而D32A-C6则不可以。对于WT-C6和D32A-C6的不同表现，我们认为是其对细胞壁纤维素的降解所产生的效果。这些结果证明，C6保守区（序列为GCNWRFDWF）是EG1发挥PAMP活性的关键区段。
　　接着，为了进一步探究EG1的具体活性位点，我们将C6区段内的所有氨基酸进行定点突变，并获得相应的突变工程菌和蛋白，将调整好浓度的纯酶接种玉米后发现，其中一个蛋白RA不能引起玉米叶片的坏死。然后，用调整好浓度的RA的纯酶接种玉米和烟草叶片，同时测定RA接种对玉米和烟草叶片活性氧产生的影响，以及对防卫反应基因表达的影响。结果发现，RA不能使玉米和烟草叶片坏死，也不能使活性氧大量产生，同时不能引起防卫反应基因的过量表达。同时利用PVX表达载体对d32a-ra进行表达，发现携带pGR106/pd32a-ra的重组质粒不能引起烟草叶片的坏死。这些实验结果初步确定了EG1的具体活性位点。
　　本研究证实了R. solani第45家族糖苷水解酶β-1,4-内切纤维素酶EG1发挥PAMP活性的关键区段，同时对其具体位点进行了初步探究。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1玉米纹枯病

1.2 植物病原真菌的致病机制

1.3 植物的抗病机制、防卫反应与抗病种质资源的筛选

1.4植物的免疫系统

1.5纤维素酶的近期研究进展

1.6立题依据

2材料与方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

3结果与分析

3.1EG1区段突变在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达

3.2 WT-C6与D32A-C6的PAMP活性的分析

3.3EG1定点突变基因的真核表达

3.4EG1定点突变基因d32a-ra的PAMP活性分析

3.5利用PVX表达系统对d32a-ra进行表达

4讨论

4.1β-1,4-内切纤维素酶EG1在毕赤酵母中的表达

4.2β-1,4-内切纤维素酶PAMP分子活性的验证

4.3PVX表达载体的应用

5结论

5.1EG1的PAMP活性区段存在于保守区段C6内

5.2推测EG1发挥PAMP活性的位点

参考文献

致谢