人血清脂联素定量ELISA检测方法的建立及脂联素的可溶表达

摘要

脂联素(adiponectin)是脂肪细胞特异分泌的血浆蛋白，它与胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等密切相关，检测adiponectin在血中的含量是研究其生理学功能及调控的手段之一，对于预测某些疾病的发生、发展有一定的意义。另外，由于adiponectin的活性主要集中在其球状区(gadiponectin)，而可溶蛋白又较包涵体有可能形成正确的折叠，从而具有一定的生物学活性，所以对adiponectin及gadiponectin的可溶表达将为其功能和作用机制的研究奠定基础，同时还能进一步制备ELISA检测所需的针对不同抗原表位的单、多克隆抗体。目前，国外检测人血adiponectin含量的方法主要有ELISA及RIA两种，其中ELISA大多采用生物素-亲和素信号放大系统，操作相对烦琐，检测周期较长，而国内尚无此类成套试剂。 目的：我们试图建立一简便、快捷的检测人血中adiponectin含量的ELISA方法，检测Ⅱ型糖尿病患者及健康体检者血中adiponectin的变化；并试图克隆表达有生物学活性的adiponectin及gadiponectin蛋白，并制备多克隆抗体，以利下一步进一步优化相关检测方法。 方法：用纯化的大肠杆菌重组表达包涵体adiponectin，免疫家兔和Balb/C小鼠分别制备多克隆和单克隆抗人adiponectin抗体，纯化后，用单抗包被微孔板，多抗标上辣根过氧化物酶，同时制备了一种新型血清或血浆样品稀释液，双抗体夹心法检测adiponectin，绘制标准曲线，检测Ⅱ型糖尿病和健康体检者血标本中adiponectin的含量，并进行统计学分析。为在此基础上进一步优化检测方法，我们以pQE30-adiponectin质粒为模板，PCR分别扩增adiponectin及gadiponectinDNA，并插入pGEX-4T-2表达载体，转化入BL21大肠杆菌，在25℃使用IPTG诱导，进行可溶性表达。可溶表达的蛋白经GSTrap柱亲和纯化后免疫家兔，制备多抗，利用Westernblot鉴定多抗与人血清中adiponectin的反应性。使用肝癌细胞和外周血单个核细胞对可溶表达蛋白进行体外生物学活性鉴定。 结果：我们建立的ELISA系统的灵敏度为0.5μg/ml，板内、板间的精密度＜8％。血清检测线性关系较好，准确性在88％-108％。新研制的血清或血浆样品稀释液是本检测系统不可缺少的部分，并已申请了国家发明专利。检测北京医院Ⅱ型糖尿病家系血清，与市售Linco试剂的相关性良好(r=0.71)，在调整了年龄、性别比和体重指数(BMI)后，Ⅱ型糖尿病患者血中adiponectin的浓度低于健康体检者(4.04±2.39vs5.87±2.96μg/mlt=3.12p=0.002)。在健康体检者，血中adiponectin浓度与甘油三酯(TG)呈显著负相关(r=-0.367p=0.009)，且在健康女性，血中adiponectin浓度负相关于BMI(r=-0.413p=0.023)。对301医院内分泌实验室提供的血清标本检测结果亦表明Ⅱ型糖尿病患者血中adiponectin的浓度显著低于健康体检者(4.26±2.65vs7.98±4.39μg/mlt=4.58p＜0.0001)。 PCR扩增的adiponectin编码DNA约710bp，gadiponectin编码DNA约430bp，构建了pGEX-4T-2-adiponectin和pGEX-4T-2-gadiponectin表达载体。将载体转化入BL21大肠杆菌后，使用IPTG在25℃诱导，有可溶表达的GST-adiponectin融合蛋白分子量约51kDa，GST-gadiponectin融合蛋白分子量约42kDa，经亲和纯化后，纯度均＞90％。体外实验结果显示，两种可溶表达的重组蛋白对肝癌细胞具杀伤作用，且对外周血单个核细胞无细胞毒作用。两种融合蛋白免疫家兔，产生的多抗，与人血清中的adiponectin均能特异性结合。 结论：我们初步建立了一种简便、快捷的ELISA检测人血中adiponectin含量的方法，血中adiponectin浓度在Ⅱ型糖尿病患者降低，与BMI和TG呈负相关。可溶表达的adiponectin及gadiponectin具有一定的生物学活性，可用于其功能和作用机制的研究及不同单克隆抗体的制备；制备的多抗，为adiponectin检测方法的优化奠定了基础。

目录

缩略语表

绪 论

第一部分人血清脂联素(adiponectin)定量ELISA检测方法的建立

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

第二部分adiponectin和gadiponectin的可溶表达及应用

一、adiponectin及gadiponectincDNA的克隆和鉴定

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

二、adiponectin及gadiponectin在E.coli中的可溶性表达及多抗制备

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

总 结

参考文献

在学期间发表及待发表文章和申请专利情况

致谢