哺乳动物细胞高效表达载体的优化

摘要

哺乳动物细胞由于有内质网和高尔基体等可用于进行蛋白质糖基化的结构和机制以及具有与人十分相似的糖基化方式，它表达的蛋白质往往具有天然蛋白的构象及生物学特性，这是大肠杆菌、酵母及昆虫表达所无法比拟的优点。但是，哺乳动物细胞表达系统也面临外源基因在哺乳动物细胞中表达水平低、获得高表达细胞株的时间长等问题。解决这些问题的至关重要的一步是哺乳动物细胞表达载体的构建及其进一步优化，因此本研究以CHO-dhfr-细胞为宿主细胞，从目的基因表达单元的优化和筛选基因的弱化两个方面对构建的哺乳动物细胞表达载体进行优化。 本研究以pMCEd-k2tPA载体为基础对目的基因表达单元中的表达调控元件进行优化研究，使用的表达调控元件有：hCMV和hEF-1α启动子、hCMVEnhancer、hEF-1α1stintron以及翻译增强子H213和V163。k2tPA是tPA的一种突变体，可以通过溶圈法测定它的表达水平，遂以k2tPA为报告基因构建了8个含有不同表达调控元件组合的定点整合型表达载体。然后在定点整合型表达系统中比较不同载体转染CHO-dhfr--Z+细胞形成克隆的k2tPA表达水平，进而比较这些不同表达调控元件的表达效率并筛选到了两种表达效率有明显提高的表达调控元件组合：hCMV启动子与H213以及hEF-1α启动子与V163组合的表达效率分别是仅含hCMV启动子的156.6％和139.5％。 同时，本研究中以Neo基因为筛选基因，采用多种方式对其进行弱化，具体的弱化方式有：在Neo基因的起始密码子前添加不同阅读框架的ATG/改变其Kozak序列、将Neo基因置于内含子中以及使用活性降低的突变体。基于上述不同的弱化方式构建了6个随机整合型载体(e、f、g、h、t和u)，通过随机整合的方法，以这些载体转染CHO-dhfr-细胞后的克隆形成率以及克隆的k2tPA混合表达水平为指标，比较了不同弱化方式的筛选效率。所构建的载体都明显低于通用的商业化哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(+)的克隆形成率，其中e、f的克隆形成率分别为：115Colonies/2.0×105Cells和62Colonies/2.0×105Cells；初步评价了g、h、t和u的筛选效率，g和h在转染2.0×106Cells时没形成克隆，t的克隆形成率(10Colonies/2.0×106Cells)比u的要低一个数量级。 本研究在目的基因表达单元的优化和筛选基因Neo基因的弱化方面都获得了较理想的结果，为进一步研究不同表达调控元件间的相互作用、实现外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达、降低生物工程制药的研究开发成本奠定了良好的基础。

目录

英文缩略语表

前言

一 材料

二 方法

三结果(一)不同表达调控元件表达效率的比较

结果(二)Neo基因不同弱化程度的筛选效率的研究

总结

参考文献

文献综述 哺乳动物细胞高效表达系统的研究进展

致谢