基于系统发育比较分析的反义药物优化设计及相关药理学研究

摘要

本文基于系统发育比较分析方法，整合计算机模拟二级结构方法进行反义药物优化设计研究，分析构效关系与系统发育保守性在反义药物设计中的意义，进一步改善QSAR方程。筛选具有应用前景的活性先导序列，考察优选序列的体内外活性。 1.选取与乳腺癌发生密切相关的HER-2为靶点，通过Genbank共获取HER-2mRNA(4530bp与1316bp)，分析HER-2mRNA的系统发育保守性；同时利用计算机模拟靶mRNA的二级结构，将局部二级结构(局域，localmotif，LMs)分为三种类型：1)完全保守局域(completelyconservativeLMs)，即一级序列完全保守、模拟mRNA最优及次优二级结构中全部具有的LMs；2)相对保守LMs(relativelyconservativeLMs)，即一级序列不完全保守、模拟的三个最优或次优mRNA二级结构中出现二次的LMs；3)变异LMs(variableLMs)，以及序列完全变异，模拟mRNA最优及次优二级结构中只出现一次的LMs。在分析二级结构特点、计算△G°R等参数的基础上，分别设计了靶向上述三个部位的共32个S-ODNs。国外报道的阳性序列HA4被设为对照，并设随机阴性对照。所有序列用blast程序在网上搜寻，剔除与非靶基因互补碱基数＞12的序列，最终合成反义硫代寡核苷酸(S-ODNs)32条。 2.体外MTT法评价所设计的S-ODNs对乳腺癌SK-BR-3细胞增殖的抑制效应，计算S-ODNs的IC50值(n=3-5)，结果采用SPSS软件进行定量构效关系(quantitativestructure-activityrelationship，QSAR)分析及多元回归。在所设计的靶向4530bpHER-2mRNA的13个S-ODNs中，4个S-ODNsIC50值(分别为53±38，43±20，41±20，58±28nmol·L-1)显著低于HA4[97±27nmol·L-1，(P＜0.05]；在所设计的靶向1316bpHER-2mRNA的S-ODNs中：11个靶向完全靶向完全保守LMs的S-ODNs中有9个获得低于或相似于HA4的IC50值；3个靶向相对保守LMs的S-ODNs中有2个获得低于或相似于HA4的IC50值；5个靶向变异LMs的S-ODNs中有2个获得低于或相似于HA4的IC50值。进一步分析发现，靶向完全保守LMs的S-ODNs的平均IC50值明显低于靶向变异LMs及相对保守LMs的S-ODNs的平均IC50值(147±43vs466±165nmol·L-1，P＜0.05)。QSAR分析结果显示，靶向4530bpHER-2mRNA的S-ODNs相关参数仅反应自由能(△G°37R)具有显著的统计学意义(R=0.604，P=0.029)，其它参数如内环、膨环、发针、S-ODNs自由能(△G°37S)、药-靶双链自由能(△G°37D)、靶局部结构自由能(△G°37T)等则无显著意义。与以往研究结果一致。对靶向1316bpHER-2mRNA的S-ODNs进行QSAR分析时发现靶mRNA局部结构稳定性、膨胀环碱基构成数与△G°37S具有统计学意义，其中稳定性参数最为显著(R=0.741，P=0.003)；而单独分析靶向完全保守的S-ODNs的结果显示：除上述变量外，内环碱基数、发针碱基数、△G°37S、△G°37R等变量也具有统计学意义(R=0.967，P=0.005)。结果表明基于靶mRNA二级结构模拟及系统发育保守性分析的药物设计有助于获得优于阳性对照的反义序列。 3.选取三个序列HA824，HA2741和HA4136，合成其相应的错序(Scramble)、随机(Random)序列等对照序列。采用HER-2表达水平不同的乳腺癌细胞株SK-BR-3、MDA-MB-453(HER-2过表达)、MDA-MB-231(HER-2低或不表达)以及正常组织细胞株NIH-3T3等，在细胞水平对上述S-ODNs进行体外抗肿瘤活性评价。结果表明，HA824，HA2741和HA4136均有明确的抗乳腺癌细胞增殖作用，其对乳腺癌细胞生长的抑制作用与HER-2基础表达水平密切相关：对HER-2高表达的SK-BR-3、MDA-MB-453细胞的增殖具有明显的剂量依赖性抑制作用；对HER-2低水平表达的肿瘤细胞MDA-MB-231以及正常组织细胞NIH-3T3等无明显的抑制增殖作用。RT-PCR，Northernblot，点杂交等手段在mRNA水平检测S-ODNs对HER-2表达的影响。结果显示，HA2741，HA824等可以剂量依赖方式显著抑制HER-2mRNA的表达，相同剂量下抑制强度大于阳性对照HA4；流式细胞术、免疫细胞化学、Westernblot等手段在蛋白水平检测S-ODNs对HER-2蛋白表达的影响。结果与mRNA水平结果一致。荧光显微镜观察结果显示，MDA-MB-453细胞经HA2741作用24～72小时后出现明显的凋亡现象，包括新月体样核固缩、核碎裂和凋亡小体的出现，而HER-2表达阴性的MDA-MB-231细胞，即使在经HA2741作用72小时后，也没有上述的形念变化。结果提示，HA2741可诱导细胞凋亡从而抑制乳腺癌细胞的增殖，HA2741诱导细胞凋亡与其特异性抑制HER-2的表达有关。 4.建立裸鼠荷人HER-2高表达乳腺癌SK-BR-3动物模型评价优选反义寡核苷酸序列HA2741的体内抗乳腺癌活性以及与化疗药物合用的协同作用。结果显示，HA2741静脉注射连续用药12天，对乳腺癌的体内生长具有明显的抑制作用。在5mg·kg-1·d-1×12d的剂量下，HA2741单用组抑瘤率达到76.3％±8.5％(观察至初次给药后5周)。在5mg·kg-1·d-1的剂量下，HA2741与泰索帝(7.5mg.kg-1.d-1)合用组的抑瘤率为88.3±4.5％，与高剂量化疗药物泰索帝单用组(15mg.kg-1.d-1)的抑瘤率(88.7±4.3％)可比拟，显著高于HA2741(5mg.kg-1.d-1)以及泰索帝(7.5mg.kg-1.d-1)各自单用。以上结果提示HA2741可以作为化疗佐剂与常规化疗药物合用，提高疗效、降低化疗药物用量，减轻化疗药物的毒副作用。

目录

前言

材料与方法

第一部分实验材料

第二部分实验方法

实验结果

第一章基于靶mRNA二级结构模拟及其保守性分析的的反义药物优化设计与QSAR分析

一、靶mRNA 同源性分析及二级结构的模拟

二、基于模拟靶mRNA二级结构的反义药物设计

三、S-ODNs体外对SK-BR-3乳腺痛细胞株生长的抑制作用

四、QSAR分析与多元回归

第二章反义药物对目的基因表达的特异性抑制作用

一、S-ODNs对HER-2 mRNA表达的特异性抑制作用

二、HA2741对HER-2 mRNA表达的特异性抑制

三、HA2741对HER-2受体表达的影响

四、S-ODNs对细胞凋亡的影响

第三章HA2741体内抗肿瘤活性初步研究

一、荷人乳腺癌移植瘤动物模型

二、HA2741对乳腺癌体内生长的影响

三、HA2741对体内肿痛HER-2受体蛋白表达的影响

讨论

参考文献

致谢

个人简历

Advancements of antisense oligonucleotides in treatment of breast cancer1

Antisense candidates against protein kinase C-a designed based on phylogenesis and simulant structure of Mrna1