siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用研究

摘要

严重急性呼吸综合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome，SARS)是人类在2l世纪初遭遇的烈性传染病之一，我国为该病的重要疫区。其病原体为SARS冠状病毒(SARSCoronavirus，SARS-CoV)。目前对其尚无特效的治疗方法，因而探索有效的抗SARS病毒新途径势在必行。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是基于RNA水平的抗病毒策略，凭借自身的特异、高效、快速等优势，它已成为抗病毒领域的研究热点之一。RNAi的发现和应用为治疗SARS病毒感染提供了新思路。 本研究拟开展以下两方面内容，观察siRNA对SARS病毒复制的抑制作用。探索抗SARS病毒感染的新途径。 一.siRNA的设计合成及其对SARS病毒部分复制酶基因的抑制作用 由于复制酶基因的表达是SARS病毒启动转录的前提，而刺突蛋白在病毒入侵宿主细胞的过程中发挥着重要作用，因此选择SARS病毒复制酶基因(rep)和刺突蛋白基因(s)的保守序列作为靶基因，设计并合成9种siRNA(pS01～09)，其中pS01～07针对rep基因，pS08～09针对s基因。由于体外合成的siRNA不易操作且基因干涉作用持续时间短，故采用构建siRNA表达载体的方法在体内合成siRNA。 同时，构建融合表达绿色荧光蛋白(GFP)基因和部分rep基因的重组载体，将已构建好的识别rep基因的siRNA表达载体与重组载体共转染293T细胞，通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析融合基因的表达情况。结果表明，针对SARS病毒rep基因第3504nt-3522nt的siRNA可使rep基因的表达量下降33％，说明siRNA可特异而有效地抑制基因的表达。 二.siRNA在Vero细胞中的抗SARS病毒作用 为进一步研究siRNA对SARS病毒复制的抑制作用，将构建的siRNA表达载体分别转染Vero细胞，获得稳定转录siRNA的克隆细胞株V/pS01、03、05～09及对照细胞株V/pSN，然后以BJ01株病毒悬液感染克隆细胞，通过病毒滴度测定和间接免疫荧光实验观察siRNA对SARS病毒复制的抑制作用。结果表明，针对rep基因和s基因的siRNA(pS05和pS08)呈现出了良好的抗病毒效果，在接种SARS病毒后均未检测到病毒的特异性抗原，且病毒滴度下降103～104倍。另外，通过实时定量RT-PCR检测病毒感染的细胞上清中rep基因的含量，结果显示，细胞株V/pS05中rep基因含量仅为对照组的1/1000倍。表明rep基因的缺失导致了SARS病毒复制能力的丧失，从而证明了siRNA对基因的转录后抑制作用是其抗病毒感染的原因。总之，本研究证明了RNAi策略应用于抗SARS病毒感染的可行性，并在细胞水平上筛选出两种对SARS病毒具有抑制作用的siRNA，它们分别针对SARS病毒rep基因的6743nt-6761nt位点和s基因的23060nt-23078nt位点。这为抗SARS病毒siRNA的设计增添了两个新的靶点。

目录

前 言

第一部分siRNA的设计合成及其对SARS-CoV复制酶基因表达的抑制作用

材料和方法

结果

讨论

第二部分siRNA对SARS-CoV复制的抑制作用研究

结 论

参考文献

文献综述 RNAi抗病毒感染的研究进展

硕士期间发表的论文和综述

致 谢

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