SARS-CoV BJ01株全长cDNA的构建及其S基因突变对病毒感染性的影响

摘要

SARS-CoV为一种新发现的人冠状病毒，属于单股正链RNA病毒，基因组全长约30kb，是已知的RNA病毒中基因组最大的一类病毒。SARS-CoV基因组结构为5'-Rep-S-E-M-N-3’，编码4种结构蛋白和多种非结构蛋白。其中刺突蛋白S为病毒最重要的结构蛋白，参与病毒与细胞受体的结合以及入侵宿主细胞的膜融合过程，决定着病毒的组织嗜性和毒力。 目前对SARS-CoV基因组结构与功能、致病的分子机理并不十分清楚，对于病毒基因组中与毒力相关的位点大多为生物信息学预测，确切的毒力位点尚未得到实验验证。由于SARS-CoV基因组较大而难以构建感染性克隆进行体外突变研究，因此构建病毒基因组全长eDNA可有效解决这一问题，为深入探讨SARS-CoV的基因组结构与功能、致病的分子机理奠定基础。 为此，本研究采用分段克隆、体外拼接策略构建了SARS-CoVBJ01株基因组全长eDNA，经体外转录制备了恢复病毒，观察了恢复病毒对敏感细胞的感染性及传代稳定性；并通过生物信息学方法对BJ01株S蛋白的可能毒力相关位点进行了分析预测和体外突变，构建了突变病毒全长cDNA。进一步观察比较突变病毒的感染性与原型病毒的差异，为寻找SARS-CoV毒力位点和揭示其致病的分子机制提供依据。 首先，构建了本实验室分离的SARS-CoVBJ01株病毒基因组全长eDNA。鉴于冠状病毒基因组较大，设计覆盖病毒全基因组的7对引物将病毒全长eDNA分为7个片段分别进行了扩增。获得的Fl～F7各cDNA片段大小分别为1．5kb，2．8kb，4．3kb，3．3kb，6．8kb，4．5kb和6．3kb。同时，为实现全长eDNA的体外转录，在病毒基因组5’端引入T7启动子核心序列。将7个cDNA片段分别克隆至pGEM-TEasy、pCR-XL-TOPO、pWSK29等不同载体，构建了BJ01株eDNA亚克隆。然后酶切重组质粒制备目的片段，分别将FI～F4和F5～F7体外连接获得基因组5’和3’半分子cDNA，再将二者进行体外连接构建BJ01株全长eDNA分子。接头处序列的测序结果表明获得了SARS-CoVBJ01株基因组全长cDNA。 为观察所构建的BJ01株病毒基因组全长cDNA在传代细胞中是否具有感染性，以获得的基因组全长cDNA分子为模板进行体外转录，将转录体RNA转染VeroE6细胞。结果在转染后72h，VeroE6细胞出现变圆、聚集成团等典型的细胞病变，表明已获得了BJ01株的恢复病毒。利用空斑法对恢复病毒进行滴度测定，空斑滴度为5×104PFU／ml，与SARS-CoVBJ01株原型病毒的滴度接近，表明获得的恢复病毒具有与原型病毒相似的感染特性。培养细胞的连续传代观察表明恢复病毒具有很好的稳定性。对恢复病毒基因组序列的特定区段进行RT-PCR扩增和测序，结果显示片段大小和序列与预期一致，表明成功获得了具有感染性的SARS-CoVBJ01株恢复病毒。 SARS-CoVBJ01株基因组全长eDNA的成功构建及恢复病毒的获得为进一步通过体外突变技术确证SARS-CoV的毒力相关位点奠定了基础。 通过对SARS-CoVBJ01株基因组序列的生物信息学分析发现S蛋白受体结合域及七肽重复区可能与病毒毒力密切相关。S蛋白318-510氨基酸序列与受体血管紧张素转换酶2(ACE2)可有效结合，受体结合域的序列比对分析提示E452及D454有可能影响病毒与受体的结合，因此推测与病毒组织嗜性及毒力有关。生物信息学分析表明SARS-CoV的S2区域也含有七肽重复序列(HR)，其组成部分HRl(900．1005)与HR2(n51．1185)具有高度保守性，可形成六螺旋束构象，在病毒入侵宿主细胞并与细胞膜发生融合的过程中发挥重要作用。因此该结构域也很可能存在SARS-CoV的毒力位点。 因此利用所获得SARS-CoVBJ01株基因组全长cDNA，通过体外突变技术在病毒亚克隆基础上对S蛋白的这些毒力相关部位进行了突变，包括受体结合域(E452及D454)2个氨基酸位点的定点突变及HR2七肽重复区105个核苷酸的缺失突变，然后构建突变病毒全长cDNA并获取突变病毒。将其感染细胞后观察突变病毒的生物学性质，并与原型病毒进行了比较分析，结果显示受体结合位点的突变明显降低了BJ01株病毒对VeroE6细胞的感染性，受体结合位点突变病毒的空斑滴度为2×102pFU／ml~HR2七肽重复区的突变则可能因破坏病毒的关键结构功能域而使其完全丧失感染能力。 本研究表明，SARS-CoVBJ01株S蛋白的受体结合位点(E452和D454)及七肽重复区(HR2)与病毒的毒力及致病性密切相关，针对该部位的突变可显著影响病毒的感染性，这一结果为深入探索SARS-CoV的致病机制及设计抗病毒策略提供了理论依据。

目录

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前 言

第一部分SARS-CoV BJ01株基因组全长cDNA的构建及恢复病毒的制备

第二部分BJ01株突变病毒全长cDNA的构建及S基因突变研究

总 结

参考文献

英文缩略词表

主要试剂、培养基及缓冲液配制

博士期间撰写的论文和综述

综述一：SARS-CoV细胞受体的研究进展

综述二：痘苗病毒载体在冠状病毒反向遗传学中的应用

致 谢