溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性 cDNA及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA及其构建方法和应用。所述溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA可以与辅助质粒组成反向遗传操作系统。该感染性cDNA及其反向遗传操作系统可用于拯救具有溶瘤功能的新城疫病毒，本发明为研究新城疫病毒的溶瘤功能及其分子机制、开发抗肿瘤基因工程治疗等奠定了实验基础。

说明书

技术领域

本发明涉及单股负链RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及具有溶瘤功能的新城 疫病毒感染性cDNA及其构建方法和应用，本发明由该新城疫病毒感染性cDNA、 微基因组及其辅助质粒所组成的新城疫病毒反向遗传操作系统。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV）属副粘病毒科禽腮腺炎病毒属的成 员，为单股负链RNA病毒，其基因组RNA全长约15kb。RNA基因组在3'末端为 55个核苷酸的前导序列，5′末端为114个核苷酸的尾随序列，这两个序列对病毒的 转录和复制都至关重要。病毒的六个基因RNA的顺序依次为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'。 新城疫病毒的这六个基因编码主要的六种结构蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid  protein,NP)、磷蛋白(Phosphate protein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、融合蛋白 (Fusion protein,F)、血凝素神经氨酸酶(Hemagglutinin Neuraminidase protein,HN)和 RNA聚合酶(Large RNA-dependent RNA polymerase protein,L)。P基因的RNA编辑 产生另外两个非结构蛋白V和W(Mebatsion et al.,2001;Steward et al.,1993)。病毒 基因组RNA和NP、P、L共同形成核糖核蛋白复合体（RNP），RNP能够作为RNA 转录和复制的模板，是病毒具有功能活性的最小感染单位(Hamaguchi et al.,1983)。

肿瘤治疗的最终目的是在对健康细胞不产生明显损伤的条件下清除癌症细胞。 多种溶瘤型病毒已经被鉴定和并对其潜在的抗肿瘤功能、特异性、效果和安全性进 行检测。在众多溶瘤病毒中，新城疫病毒已经被认为是有希望的溶瘤制剂被作为实 验治疗应用于临床已40余年。一些临床试验表明NDV是安全有效的治疗制剂。新 城疫病毒现已成为临床评估作为溶瘤、基因及免疫刺激治疗载体的五种病毒之一， 极具开发价值。

反向遗传操作系统是在分子水平研究病毒的重要工具之一。通过在DNA水平 上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因缺失、基因 插入、基因替换和基因互补（构建嵌合病毒）等改造，以解决对RNA病毒基因组 难以操作这一难题，极大地方便了人们在分子水平上研究病毒基因的功能及其具有 的生物学特性的分子机制。

研究表明，新城疫病毒溶瘤株73-T可以杀死多种人癌症细胞。在裸鼠模型中， 肿瘤内注射73-T能明显抑制多种异种移植的肿瘤，包括纤维肉瘤和神经胶质瘤。溶 瘤型MTH-68株能明显部分或全部抑制癌细胞转移型肿瘤。一期临床试验表明，溶 瘤新城疫PV701株具有广谱的抗肿瘤功能。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有溶瘤作用的新城疫病毒D90株的全长感染 性cDNA。

所述溶瘤型新城疫病毒的全长感染性cDNA克隆与亲本新城疫D90株天然序列 （SEQ ID NO:1所示）相比，缺失掉一个KpnI酶切位点，仅具有单一KpnI酶切位 点是全长感染性cDNA克隆的分子标签。

本发明的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性cDNA，其特征在于：所述的 全长感染性cDNA序列为SEQ ID NO:2所示。

本发明的目的之二在于提供一种构建所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感 染性cDNA的方法，包括：

1）以新城疫病毒D90株的RNA为模板，分11段扩增D90株基因组，进行全 基因组序列测定，得到的新城疫D90株病毒的全基因组序列如SEQ ID NO:1所示；

2）通过RT-PCR方法获得新城疫病毒D90株基因组各部分的4个片段，将所 扩增的PCR片段采用同源重组的方法组装克隆到质粒载体中，构建带有溶瘤型新城 疫病毒的全长感染性cDNA的质粒载体。

其中所述的新城疫病毒D90株（新城疫病毒D90株对肺癌A549细胞的抑制作 用，符芳等，《中国预防兽医学报》，2007年02期）由中国农业科学研究哈尔滨兽 医研究所猪传染病室猪病分子诊断组分离并保存。

在本发明中，优选的，所述的全长感染性cDNA的序列如SEQ ID NO:2所示， 与SEQ ID NO:1所示的亲本新城疫D90株天然序列相比，其缺失掉一个KpnI酶切 位点。

在本发明中，优选的，所述的质粒载体为加入T7启动子、核酶和T7终止子的 pBR322载体。

本发明的目的之三在于提供一种溶瘤新城疫病毒反向遗传操作系统，其特征在 于：该溶瘤型新城疫病毒反向遗传操作系统包括包含本发明所述的溶瘤型新城疫病 毒D90株的全长感染性cDNA的质粒载体和三个辅助质粒，其中所述的三个辅助质 粒是将溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的开放 阅读框ORF cDNA分别克隆在pCI-neo载体T7启动子下游的多克隆位点构建得到 的。

在本发明中，优选的，所述溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的开放阅 读框ORF cDNA如SEQ ID NO:3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的 开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋 白L基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:5所示。

本发明的目的之四在于提供所述全长感染性cDNA在拯救新城疫病毒中的应 用，其包括将所述的全长感染性cDNA和三个辅助质粒共转染哺乳动物细胞，拯救 得到新城疫病毒，其中所述的三个辅助质粒是将溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白 NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA分别克隆在pCI-neo 载体T7启动子下游的多克隆位点构建得到的。

在本发明中，优选的，溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的开放阅读框 ORF cDNA如SEQ ID NO:3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的开放 阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L 基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:5所示。

在本发明中，优选的，所述的哺乳动物细胞为BHK-21细胞。

本发明的目的之四在于提供所述的反向遗传操作系统在拯救新城疫病毒中的 应用。

实验表明，利用本发明所构建的溶瘤型新城疫病毒的全长感染性cDNA可以成 功拯救出溶瘤型新城疫病毒。

本发明的感染性cDNA的成功构建将为研究溶瘤型新城疫病毒提供一个有力的 基因操作技术平台，方便对新城疫病毒度基因组的操作。

附图说明

图1为D90全长cDNA质粒KpnI单酶切结果；

M：Marker DL15,000；1:D90全长质粒;2：D90全长质粒KpnI单酶切产物;

图2为微基因组及辅助质粒功能验证结果；

A：D90minigenome和辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L；B：D90minigenome

图3：拯救病毒F1、F5和F10代分子标签测序结果；

图4拯救病毒和亲本病毒在鸡胚成纤维细胞CEF上的生长动力学曲线；

图5MTT法检测拯救病毒的溶瘤特性；

图6为pBR322-THT载体图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：D90株全基因组序列测定

1、生物材料准备：

新城疫病毒D90株（新城疫病毒D90株对肺癌A549细胞的抑制作用，符芳等， 《中国预防兽医学报》，2007年02期）由中国农业科学研究哈尔滨兽医研究所猪 传染病室猪病分子诊断组分离并保存。

用包含NDV F裂解位点的引物4501-6484U/4501-6484L扩增，经序列比对， 结果表明，D90株F裂解位点具有强毒R-R-Q-K-R-F-I序列特征，因此，根据NDV 强毒序列设计如表1所示引物，扩增D90株全基因组序列。

2、病毒的纯化

采用SPF鸡胚有限稀释纯化的方法纯化NDV D90病毒。首先测定D90的HA， 将病毒连续梯度稀释后取最高稀释倍数的稀释液接种SPF鸡胚(100ul/枚)，弃掉24 小时内死亡的鸡胚，每隔3天收获鸡胚尿囊液测定HA，再用同样方法连续稀释病 毒纯化3代，收获的第3代病毒尿囊液作为种毒用于全基因组序列的测定。

3、病毒RNA的提取、反转录和RT-PCR

取D90病毒尿囊液，按照QiagenRNA提取试剂盒说明书提取基因组RNA，之 后用Promega M-MLV反转录酶反转录后获得cDNA,用Primer Star高保真DNA聚 合酶PCR扩增PCR产物，每个片段做三个反应，之后PCR产物用纯化试剂盒或胶 收试剂盒按照说明书纯化。纯化后的PCR反应产物送北京华大基因公司测序。所用 PCR扩增引物见表1：

表1：D90全基因组测序引物

引物名称 引物序列 1-1495U ACCAAACAGAGAATCTGTGAGGTACG 1-1495L CATGCTGTTCGCCACTGCTCT 348L CACCTGAGAATGGGAGCATAAGA 1258-3042U TGCTGAGCTAAAACTAACCCTG 1258-3042L GGCGTTTGATCTTCCTGATCTC 2817-4706U CCCGGAGACCCATCTCCTTAC 2817-4706L GACCCTGTCTGAGACGAGGTGTA 4501-6484U AACACGGGTAGAAGAGTCTGG 4501-6484L GCGCCATGTGTTCTTTGCTTC 9859-11885U GGACCAGAAGAAACAGATAAAAGAG 9859-11885L CTGCTCATCTCCGCTGTCACATT 11675-13649U TTCTTATCCAATAGATCCAACCACCC 11675-13649L CCAAGAAGATGAAGCAGTCCCTAT 13528-15155U AGCAAGGTACGACGCATTTACAC 13528-15155L GGGACGACTTTGCGCACTCTTGCTT 14947-15193U CATGAAAACCATAGGTAATGCTG 14947-15193L ACCAAACAGAGATTTGGTGAATG 6299-8150U CTGGGAACAAGCAACCAAAGAG 6299-8150L CGGCCAAGTCTAGCTTCTTAAACTC 8000-9978U CATCGACATGTTTTAAAGTTGTCAAG 8000-9978L GGTACTCGAGGGTTGTCAGGTATT 兼并15193L ACCAWACAYAGATTTGGTGYATG 兼并1U ACCAAACAGAGAATCYGTGAGRTACG

4、结果：

D90全长基因组序列全长为15192bp，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：D90株感染性全长cDNA的构建

根据上述溶瘤型新城疫病毒D90株全基因组序列测定结果及酶切图谱分析，将 D90株全长分成4段，设计4对引物，见表2。

表2

分别用表2引物PCR扩增F1-F4片段以及linker，其中，利用overlap PCR技 术（引物名称为：MF4-F-L和MF4-R-U）在F4段中引入D90株全长感染性cDNA 分子标签（第13996位A-T），从而将KpnI酶切位点突变掉，从而使全长cDNA中 仅存在唯一KpnI酶切位点。

上下游linker引物，退火形成双链DNA。Linker包含StuI、PsiI、SpeI、MluI 和SmaI酶切位点。T7启动子和核酶HdvRz间存在StuI和SmaI酶切位点，用StuI 和SmaI双酶切pBR322-THT载体，载体图谱如图6所示，与linker连接，命名为 pBR-linker载体。

按照F4-F1-F2-F3的顺序，利用同源重组的方法，依次连入包含T7启动子、核 酶和T7终止子的pBR322载体（pBR322-THT），具体操作为：用MluI、SmaI酶切 载体pBR-linker，与PCR获得的F4片段同源重组，获得的阳性克隆pBR-F4；用StuI、 PsiI酶切后的pBR-F4载体与F1片段同源重组，获得pBR-F4F1；用Psi、SpeI酶切 pBR-F4F1与F2片段同源重组，获得pBR-F4F1F2；用Spe、MluI酶切pBR-F4F1F2 与F3片段同源重组，获得最终包含D90全长cDNA的pBR-D90。其中，D90株全 长感染性cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

对构建的感染性克隆进行全基因组测序，保证碱基序列的忠实性。并用KpnI 单酶切鉴定验证分子标签引入成功。结果如图1所示。

实施例3：D90微基因组质粒、辅助质粒的构建及功能验证。

1、辅助质粒的构建

取D90病毒尿囊液，按照QiagenRNA提取试剂盒说明书提取基因组RNA，之 后用Promega M-MLV反转录酶反转录后获得cDNA,设计三对引物分别用于扩增 编码核蛋白NP、磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因ORF的cDNA，辅助质粒构建所用 引物，见表3：

表3

将扩增得到的编码核蛋白NP、磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因ORF的cDNA分 别进行酶切后克隆在采用相同酶进行酶切后的pCI-neo载体T7启动子下游的多克隆 位点，构建成的辅助质粒分别命名为pCI-NP、pCI-P和pCI-L。其中，溶瘤型新城 疫病毒D90株核蛋白NP基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:3所示，溶 瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:4所 示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的开放阅读框ORF cDNA如SEQ ID NO:5所示

2、D90微基因组质粒的构建

将PCR扩增获得的D90株Leader区 （ACCAAACAGAGAATCTGTGAGGTACGATAAAAGGCGAAGAAGCAATCGAGATCGTACGGGTAG AAGGTGTGAACCCCGAGCGCGAGGCCGAAGCTTGAACTTGAGGGAACCTTCTACCGAT）,trailer 区（GGGCAATCGTACGCCAATCAGTTATCTTCTTAACTGATGACTCCCTCACTGACTTAgTTATACCGGgTTAGAA AAAAGTTAAATTCCGACTCTTTGGAACTCGTATTCGGATTCAGTTAGTTAACTTTAAGCAAAAGTGCGCAAAGTCGT CCCTAATTATAGTTATGTCATTCACCAAATCTCTGTTTGGT）和eGFP序列overlap后获得DNA片段 LGT反向克隆于pBR322-THT载体中，构建成的微基因组质粒命名为minigenome。 将总共2ug的微基因组质粒minigenome与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L按照转 染试剂Lipofectamine^TM2000操作说明共转染BHK-21细胞，将未转染minigenome 质粒的组合作为阴性对照。转染24小时后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋 白的表达情况。结果见图2，结果表明证明D90的前导序列和尾随序列能够在T7 启动子下具有包装病毒的活性，也证明了构建的辅助质粒pCI-NP，pCI-P和pCI-L 具有功能活性。

实施例4：溶瘤型新城疫病毒D90株病毒的拯救

1、溶瘤型新城疫病毒D90株病毒的拯救

将BHK-21细胞铺于六孔板中生长至80-90%单层，将DMEM换为opti-MEM 培养基，将总共10ug全长质粒pBR322-D90，pCI-NP，pCI-P和pCI-L用转染试 剂Lipofectamine^TM2000共转染BHK-21细胞，6小时后换液，继续孵育3天。收获 培养液及细胞，反复冻融3次后接种9日龄SPF鸡胚，接种后的SPF鸡胚继续培养 3天后进行新城疫病毒的HA试验，收获HA阳性的尿囊液，分装后-70℃冻存备 用。拯救病毒在SPF鸡胚中连续传15代，分别用F1、F5、F10代收获的鸡胚尿囊 液提取总RNA，反转录后扩增含有标签部分的DNA片段进行测序，确认标签的存 在。结果如图3所示，结果表明F1、F5、F10代拯救病毒的分子标签稳定存在。

2、拯救病毒rD90的生长动力学曲线

为测定拯救病毒的生长特性与亲本毒是否一致，拯救病毒和亲本病毒的以 MOI=0.01接种已长满单层CEF细胞的6孔板。在接种后12小时、24小时、36小 时，48小时，60小时和72小时取样，反复冻融三次后，在长满单层CEF细胞的 96孔板中，测定各时间点收获细胞培养物的TCID50，绘制拯救病毒和亲本毒的生 长动力学曲线。结果见图4，结果表明拯救病毒与亲本病毒在鸡胚成纤维细胞CEF 上的生长动力学基本相同，拯救病毒保持了亲本病毒的生长特性。

3、拯救病毒rD90溶瘤特性的验证

分别将亲本毒D90和拯救病毒rD90以MOI=1接种长满单层的A549肺癌细胞， 接种40h后，用MTT法测定细胞存活率，结果见图5，结果表明拯救病毒维持了亲 本病毒的溶瘤特性。