新城疫病毒TS09-2株全长cDNA克隆的构建及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

摘要

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)为副粘病毒科副粘病毒属成员，其引起的新城疫(Newcastle Disease，ND)是一种高传染性高破坏性的疾病，被国际兽医局认定为两种A类禽病之一。当前，新城疫的防控以免疫预防为主，以NDV V4耐热株为代表的耐热活疫苗具有耐热、冷链要求低、使用方便、毒力低、免疫效果好和可同居感染等优点，在我国及其他发展中国家有着广阔的应用前景。现已有的NDV耐热毒株有V4、I-2、HB92、B95和TS09等，其中TS09株是我课题组经过对V4株的鸡胚耐热选育、纯化获得的。如能够采用反向遗传操作技术将NDV耐热毒株改造为耐热载体，插入其他禽类疫病的主要免疫源性基因，研发出禽类主要疫病的多联(多价)耐热活疫苗，将对禽病的防控带来深远的影响。但是，关于NDV耐热毒株反向遗传操作系统的成功构建至今仍未见报道。因此，本研究以TS09耐热株为研究对象，开展了NDV耐热毒株反向遗传操作系统的构建工作。
　　 一、新城疫病毒耐热株的细胞适应培养
　　 现有的反向遗传操作系统大多是在细胞上建立的，而TS09株为鸡胚适应株，不能在细胞上高效增殖。首先开展了TS09株的BHK细胞适应性培养及纯化工作。细胞培养条件的优化结果表明，0.2μg/mL的TPCK胰酶浓度为最大无毒浓度。连续17代传代培养及3次极限稀释法纯化，获得了一株新的、纯化的、适应BHK细胞的NDV耐热株，命名为TS09-C株。TS09-C株的生物学特性测定结果表明：TS09-C株的EID50值由原有的108.6/mL下降至105.7/mL，但TCID50值由原有的103.3/mL上升至107.9/mL，表明TS09-C株为细胞适应毒，且保持了亲本株的弱毒和耐热的特性，成功选育了新城疫耐热株细胞适应毒株。此外，序列分析结果表明：TS09、TS09-C和V4株仍保持着较近的遗传进化关系。
　　 二、TS09-C株的全基因组序列测定与分析
　　 设计了10对PCR引物对TS09-C株的全基因组进行了序列测定与分析。测序结果经序列拼接后获得TS09-C全基因组序列，全长15186nt。序列分析表明TS09-C和I-2、I-2progenitor、Ulster-67共处在I型分支上，编码6个结构蛋白(NP、P、M、F、HN和L)和两个非结构蛋白(V和W)；通过比对TS09-C株和V4株各基因的氨基酸同源性，发现M基因的同源性最低，为92.3%；F和HN的同源性较高，均大于99%。HN蛋白糖基化位点分析表明，TS09-C株HN蛋白仅含有4个糖基化位点，缺失119位和508位糖基化位点。
　　 采用生物信息学技术对TS09-C株的耐热机理进行了初步探讨。比较包括TS09-C株在内的4株耐热株和非耐热株氨基酸序列时，共发现23个耐热株特有的氨基酸差异，其中大部分为保守性突变，非保守性突变仅发现在P和W蛋白上。蛋白质二级结构比较分析表明耐热株和非耐热株的二级结构上的差异主要在HN蛋白的α螺旋区。这些耐热株特有位点(或结构)的发现为我们进一步研究其耐热提供了思路。
　　 三、TS09-C株全长感染性cDNA克隆的构建
　　 参考已经获得的TS09-C株全基因组序列，并进行酶切位点分析，设计出了TS09-C株全长感染性cDNA克隆的构建策略。共设计了8对引物用于全长cDNA克隆的构建。通过高保真RT-PCR，扩增出了8个片段(A、B、C、D、E、F、G1和G2)，G1和G2通过融合PCR形成G片段。在A片段的上游引入了T7 RNA聚合酶的启动子，G片段通过融合PCR在其下游引入了T7 RNA聚合酶的终止子和丁型肝炎病毒核酶序列。通过酶切连接的方法构建出三个中间质粒：pBR-ABC，pBR-DE和pBR-FG。再通过酶切连接的方法将ABC和DE插入pBR-FG中形成pBR-TS09-C全长质粒。经测序分析，与TS09-C株全基因组序列相比，全长质粒上有6处突变，其中4处同义突变，仅两处突变引起了氨基酸的改变，分析表明：这两处氨基酸突变在NDV其他毒株中也同样存在，不会影响到后续病毒的拯救恢复。
　　 四、新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用
　　 为给后续的新城疫研究提供快捷的定量检测方法，本研究建立了新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法。经对部分发表在NCBI里的新城疫病毒序列进行比对，在其F基因上找到一个相对保守序列，根据保守序列设计一对引物和一条TaqMan探针。以新城疫I系疫苗株(Mukteswar株)作为标准品，通过系列条件优化、特异性、灵敏性和重复性实验，建立了一种灵敏度高、特异性强和重复性好的荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法。该方法能检测最低初始病毒浓度为102.2ELD50/mL，且在1082-1022ELD50/mL范围内Ct值与病毒的浓度的对数值(1gELD50/mL)呈很好的线性关系，R2达到0.9975；该方法与禽流感病毒、禽痘病毒和禽大肠杆菌等禽病病原核酸无交叉反应；批间和批内重复性良好；临床样品检测中荧光RT-PCR与鸡胚分毒的符合率、诊断灵敏度和诊断特异性分别为98.5%、50%和98.4%。因此，荧光RT-PCR检测方法的建立为新城疫病毒检测提供了一种快速有效的方法，为新城疫病毒的研究提供了技术平台。
　　 综上所述，本论文主要完成了新城疫病毒耐热株细胞适应培养、TS09-C株全基因组的测序与分析和TS09-C株全长感染性cDNA克隆的构建等研究，为新城疫耐热株反向遗传操作系统的建立打下了良好的工作基础。新城疫荧光RT-PCR检测方法的建立为后续的新城疫研究提供了技术平台。

目录

文摘

英文文摘

略缩词表

第一章 文献综述

1 新城疫研究现状

1.1 基因组

1.2 病毒蛋白研究现状

1.3 新城疫病毒培养特性

1.4 新城疫病毒耐热特性研究

2 新城疫病毒反向遗传技术研究进展

2.1 反向遗传技术应用于病毒蛋白功能的研究

2.2 新城疫病毒反向遗传技术在肿瘤治疗中的应用

2.3 反向遗传技术制备基因工程疫苗

3 荧光定量技术研究进展

3.1 染料法荧光定量技术

3.2 探针法荧光定量技术

4 目的和意义

第二章 新城疫病毒耐热株的细胞适应培养

1 材料和方法

1.1 病毒

1.2 细胞及试剂

1.3 主要仪器

1.4 红细胞的制备

1.5 BHK细胞培养

1.6 TPCK-胰酶浓度的优化

1.7 NDV TS09株在BHK细胞上的传代

1.8 NDV毒株的生物学特性测定

1.9 NDV毒株F、HN基因的扩增与测序

1.10 NDV毒株F、HN基因的序列分析

2 实验结果

2.1 胰蛋白酶最适浓度的优化

2.2 TS09株在BHK细胞中的传代培养

2.3 TS09-C株F、HN基因的序列测定与分析

2.4 NDV毒株F基因的同源性分析

2.5 NDV毒株的遗传进化分析

3 讨论

第三章 NDV TS09-C株全基因组序列的测定与分析

1 材料方法

1.1 病毒

1.2 酶和试剂

1.3 引物设计和合成

1.4 基因组全长的分段扩增和测序

1.5 NDV TS09-C株全基因组序列的分析

2 结果

2.1 PCR扩增结果

2.2 序列分析

2.3 耐热分析

3 讨论

3.1 引物设计

3.2 序列分析

3.3 耐热分析

第四章 NDV TS09-C株全长cDNA克隆的构建

1 材料和方法

1.1 酶和试剂

1.2 引物设计

1.3 NDV TS09-C株全长cDNA克隆构建策略

1.4 病毒RNA的提取、反转录及PCR

1.5 引物自延伸反应

1.6 融合PCR

1.7 酶切反应

1.8 连接反应

1.9 DH5α感受态细胞的制备

1.10 转化实验

1.11 测序分析

1.12 质粒稳定性测定

2 结果

2.1 目的片段的扩增

2.2 构建各质粒的酶切鉴定

2.3 测序分析

2.4 质粒稳定性试验

3 讨论

3.1 全长cDNA克隆的构建思路

3.2 PCR扩增以及产物的连接

3.3 质粒的酶切鉴定及测序

第五章 新城疫荧光定量检测的建立

1 材料方法

1.1 病毒和样品

1.2 试剂和主要仪器

1.3 引物及探针的设计合成

1.4 病毒、细菌核酸提取

1.5 荧光RT-PCR方法的建立

1.6 标准品的制备

1.7 灵敏性试验及标准曲线的绘制

1.8 临床应用

2 结果

2.1 荧光反应条件的优化

2.2 灵敏性实验

2.3 特异性实验

2.4 重复性实验

2.5 临床样品检测结果

3 讨论

结 论

参考文献

致谢

附录 硕士期间发表文情况