细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ可溶性结构域的结构改变、转换和功能研究

摘要

细胞色素c氧化酶是哺乳动物线粒体或细菌呼吸链上的末端酶,催化电子从细胞色素c到O<,2>的转移并使后者还原为水.该酶是一个复合的膜蛋白,包括多个亚基及不同的金属活性中心.其中,亚基Ⅱ中的Cu<,A>中心被认为是电子从细胞色素c进入该酶的入口,在生理过程中起着重要作用.细胞色素c氧化酶的缺损或不足可导致许多疾病,在一些退行性疾病(如:老年痴呆症)或癌症研究中已发现了与其相关的基因突变.该工作以该酶的亚基Ⅱ可溶区为研究对象,成功表达并获得了Paracoccus versutus的细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ可溶区重组蛋白(128-280位的氨基酸序列);通过基因工程方法构建突变体蛋白,研究了Trp121和Vall62氨基酸残基在该酶中的重要地位,报道了突变和其它物理化学因素引起的蛋白结构改变、转换,以及与此相关的性质和功能变化.Trp121和Vall62的氨基酸突变可使细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ可溶区的Cu<,A>中心及二级结构发生转变,其它因素包括升湿,pH的改变以及变性剂等也可以导致蛋白质同样的结果,表明该酶的亚基Ⅱ可溶区极易发生构象转换.对Trp121和Vall62的残基置换也不同程度的影响了蛋白的电子传递功能,含有Cu<,A>中心的突变体W121Y和V162M保留了电子传递功能,而导致Cu<,A>中心破坏的突变体W121L、ΔW121和V162W不再与细胞色素c进行电子交换.由此可见,突变所造成的Cu<,A>中心结构的破坏是抑制蛋白电子传递功能的直接原因;而在Cu<,A>中心可心保持的突变蛋白中,由于氨基酸取代所造成的局部环境扰动以及蛋白稳定性的减小等因素也会影响该可溶性结构域与细胞色素c之间的电子转移,氨基酸残基Trp121和Val162对蛋白的结构、性质和正常功能的发挥都具有非常重要的作用.

目录

文摘

英文文摘

第一章绪论

一.细胞色素c氧化酶

二.细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ及其CuA可溶区

三.论文设计及主要内容

参考文献

第二章细胞色素c氧化酶可溶性结构域的野生型及其Trp121位突变体蛋白的制备

一.野生型蛋白的体外表达、重组和纯化

二.突变体W121Y、W121L和△W121的基因构建和蛋白制备

参考文献

第三章可溶性CuA结构域的性质及其Trp121位突变对蛋白结构的影响

一.SDⅡ野生型和突变体蛋白的光谱特征

二.Trp121位突变对蛋白活性中心和二级结构的影响

参考文献

第四章SDⅡ野生型及其Trp121位突变体蛋白的功能研究——与细胞色素c的电子传递

一.前言

二.SDⅡ野生型及突变体与细胞色素c的电子传递

三.影响可溶性CuA结构域电子传递的因素

参考文献

第五章SDⅡ野生型及其Trp121位突变体的稳定性及去折叠研究

一.前言

二.SDⅡ野生型及突变体的热变性研究

三.pH对SDⅡ蛋白稳定性和折叠的影响

四.盐酸胍诱导的蛋白去折叠

五.小结：关于蛋白构象转化和稳定性的讨论

参考文献

第六章一个与疾病相关的SDⅡ蛋白突变位点--Val162的研究

一、前言

二、CcO可溶性结构域中V162M，V162W突变体的基因构建和蛋白制备

三、可溶性CuA结构域Val 162位突变蛋白的性质研究及结构转化

四、功能研究—Val162突变体与Cytc的电子传递

小结

参考文献

附录

攻读博士期间已发表和待发表的论文情况

致谢

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