慢性乙型肝炎合并肝癌患者树突状细胞负载HBV抗原的研究

摘要

目的：研究慢性乙型肝炎合并肝细胞癌患者髓样树突状细胞负载HBV抗原后表型和功能的变化。 方法：成分血分离机采集31例慢性乙肝合并肝细胞癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)，体外在GM-CSF和IL-4的作用下诱导mDC分化、发育，加入“细胞因子鸡尾酒”(IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2)促进mDC成熟，并在加入促成熟因子前分别用HBcAg和HBsAg致敏mDC，LPS作为对照抗原，检测抗原致敏对mDC表型和功能的影响。 结果：在慢性乙肝合并肝细胞癌患者中：1.mDC表面分子表达：不成熟mDC表面分子CD80、CD83表达的阳性细胞百分率明显低于成熟mDC(CD80：9.3％±3.3％vs34.0％±20.7％，CD83：4.5％±2.7％vs13.2％±6.5％，均P＜0.05)；经HBcAg致敏的mDC表面分子CD80、CD86、CD40、HLA-DR表达的阳性细胞百分率较无抗原致敏时明显增加(CD80：58.3％±21.1％vs34.0％±20.7％，CD86：79.8％±12.9％vs45.2％±22.0％，CD40：69.8％±12.8％vs54.2％±23.2％，HLA-DR：78.4％±11.7％vs54.6％±20.7％，均P＜0.05);经HBsAg致敏的mDC表面分子CD86、HLA-DR表达的阳性细胞百分率较无抗原致敏时明显增加(CD86：70.2％±9.1％vs45.2％±22.0％，HLA-DR：72.3％±3.9％vs54.6％±20.7％，均P＜0.05)；经LPS致敏的mDC表面分子CD80、CD86、CD40、CD83、HLA-DR表达的阳性细胞百分率较无抗原致敏时明显增加(CD80：57.0％±7.1％vs34.0％±20.7％，CD86：96.5％±2.1％vs45.2％±22.0％，CD40：79.5％±24.8％vs54.2％±23.2％，CD83：46.5％±0.7％vs13.26％±6.52％，HLA-DR：97.5％±2.1％vs54.6％±20.7％，均P＜0.05)。2.mDC分泌的细胞因子：经HBcAg致敏的mDC分泌细胞因子IL-10和IL-12的量明显高于无抗原致敏组(IL-10：49.4±33.6pg/mlvs18.6±5.5pg/ml，IL-12：658.1±306.7pg/mlvs122.4±87.1pg/ml，均P＜0.05)；经HBsAg致敏的mDC分泌IL-12的量高于无抗原致敏组(312.1±209.2pg/mlvs122.4±87.1pg/ml，P＜0.05)，而IL-10在两组间比较无统计学差异;经LPS致敏的mDC分泌IL-10和IL-12的量明显高于无抗原致敏组(IL-10：40.7±1.1pg/mlvs18.6±5.5pg/ml，IL-12：908.0±6.3pg/mlvs122.4±87.1pg/ml，均P＜0.05)。3.mDC刺激自体T淋巴细胞增殖：HBcAg和HBsAg致敏的mDC刺激自体T淋巴细胞增殖的效果均高于无抗原致敏组(P＜0.05)，在LPS致敏组也发现了同样结果(P＜0.05)。4.mDC介导自体T淋巴细胞分泌IFN-γ：HBcAg致敏的mDC介导自体T细胞分泌的IFN-γ的频数明显高于无抗原致敏组(43.5±32.8SFC/105T细胞vs13.3±9.1SFC/105T细胞，P＜0.05);HBsAg致敏的mDC介导自体T细胞分泌IFN-γ的频数明显高于无抗原致敏组(23.2±12.9SFC/105T细胞vs13.3±9.1SFC/105T细胞，P＜0.05)；LPS致敏的mDC介导自体T细胞分泌IFN-γ的频数明显高于无抗原致敏组(61.9±55.3SFC/105T细胞vs13.3±9.1SFC/105T细胞，P＜0.05)。5.mDC介导自体抗原特异性CD8+T细胞的产生：HBcAg致敏的mDC诱导抗原肽段(HBcAg18-27)特异性CD8+T细胞产生的百分比高于无抗原致敏组(0.06％±0.01％vs0.0％±0.0％，P＜0.05);HBsAg致敏的mDC诱导抗原肽段(HBsAg183-191)特异性CD8+T细胞产生的百分比高于无抗原致敏组(0.03％±0.01％vs0.0％±0.0％，P＜0.05)；LPS致敏的mDC对于诱导HBV抗原肽段特异性CD8+T细胞的产生并无显著作用(HBcAg18-27：0.02％±0.01％vs0.0％±0.0％，HBsAg183-191：0.0％±0.0％vs0.0％±0.0％，P＞0.05)。 结论：体外经HBV抗原致敏mDC可以提高其表面共刺激分子和MHC分子表达的阳性细胞百分率，提高mDC分泌细胞因子IL-10和IL-12的水平，增强mDC刺激自体T淋巴细胞增殖的能力，促进mDC介导自体T淋巴细胞分泌IFN-γ，并有助于mDC介导自体抗原特异性CD8+T细胞的产生。本研究为乙肝病毒抗原特异性的DC疫苗治疗慢性乙肝或乙肝合并肝细胞癌的临床应用提供了实验依据。

目录

缩略语索引

前言

第一部分慢性乙型肝炎合并肝癌患者髓样树突状细胞的体外培养和HBV抗原负载

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分慢性乙型肝炎合并肝癌患者髓样树突状细胞负载HBV抗原后表型的研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三部分慢性乙型肝炎合并肝癌患者髓样树突状细胞负载HBcAg后功能的研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

总结

致谢

治疗慢性乙型肝炎的树突状细胞疫苗的研究进展

流式细胞仪检测细胞内细胞因子的研究进展

攻读硕士学位期间发表及待发表的文章