乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒负载的树突状细胞抗原提呈能力的研究

摘要

目的：树突状细胞(dendritic cells，DC)作为目前发现的抗原提呈能力最强的专职抗原提呈细胞，控制着免疫应答的性质、强度和免疫记忆性。随着DC体外培养技术的建立，已有多项研究表明，体外培养的不成熟DC可高效摄取病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，不仅可诱导体液免疫的发生，而且可通过交叉抗原提呈途径，激发细胞免疫反应。在此过程中，VLPs除作为抗原表达载体为DC提供了特异性抗原外，还可刺激DC成熟，诱导DC的MHC-I和II类分子及一些黏附分子的表达。因此，用VLPs负载DC，构建DC疫苗，为肿瘤和胞内感染病原疫苗的研制开辟了新的途径。 乙肝病毒核心抗原(Hepatitis B core，HBc)是乙肝病毒的重要结构蛋白，在细菌、酵母菌及哺乳动物细胞内均能高效表达、自动装配成球形颗粒，并可插入外源短肽，同时保持外源肽或表位正确构象，有较强免疫原性。因此，用HBc-VLPs负载DC，可能是DC疫苗研究的较好模型。 随人类基因组计划实施和推进，生命科学研究进入后基因组时代，新的学科-蛋白质组学(Proteomics)诞生。蛋白质组学可刚来研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律，能从更深一层次认识生命活动的规律。 基于上述原因，在本研究中，我们在原核系统表达了乙肝核心蛋白，以其组装成的乙肝核心蛋白病毒样颗粒(HBc-VLPs)为模型，首次采用能获得高通量信息的蛋白质组学技术研究DC摄取HBc-VLPs后细胞整体蛋白谱的改变，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS)鉴定得到了有意义的蛋白质，为研究DC细胞活化和DC疫苗的免疫机制提供了新的线索和思路。 方法：(1)乙肝核心蛋白病毒样颗粒的制备：扩增pET28a-HBc的工程菌，IPTG诱导蛋白表达，包涵体形式表达的HBc蛋白的变性、Ni-NTA亲和层析纯化和复性。(2)HBc-VLPs的鉴定：通过SDS-PAGE电泳、蛋白免疫印迹实验检测HBc蛋白的表达和免疫原性，透射电镜观察HBc蛋白VLPs的形成。(3)小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养：树突状细胞由小鼠骨髓获得经细胞因子rmlL-4和rmGM-CSF诱导分化成为未成熟BMDC。(4)BMDC对HBc-VLPs的吞噬：激光共聚焦显微镜观察不同时间点小鼠BMDC对HBc-VLPs的吞噬。(5)流式细胞仪分析BMDC表面分子标记：FITC标记的抗小鼠CD11c抗体SDFITC标记的抗小鼠CD86、CD80和MHC-II分子抗体表面染色后，流式细胞仪检测。(6)细胞因子的mRNA水平测定：常规方法抽提不同处理组BMDC细胞的总RNA，将mRNA反转录为cDNA片段。用合成的细胞因子(IFN-γ、TL-12)和内参照(β-actin)的引物，扩增cDNA片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测。(7)BMDC摄取HBc-VLPs前后细胞总体蛋白表达的差异及差异蛋白的质谱分析：①摄取HBc-VLPs前后BMDC细胞总蛋白的二维电泳：I蛋白样品的准备：提取细胞蛋白经Clean-Up处理后，BCA法测定蛋白样品浓度。II二维电泳：一向：等电聚焦，每根IPG上样150μg，经30伏持续低电压水化、200伏，1小时除盐后，梯度升压、稳压至8000伏，持续6-8小时，保证总量为50000伏特小时；二向：聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：灌制板胶、将胶条平衡处理后转移至胶板、20 mA/gel垂直电泳5-6小时。Ⅲ硝酸银染色：固定、敏化、漂洗、硝酸银染色、漂洗、显色、终止、漂洗、1％乙酸中保存。②蛋白点分析与选取：凝胶通过ChemiIanlgeTM 5500成像系统获得数字化的图像。使用计算机应用图像软件IamgerMasterTM 5.0对图像进行分析，选取明显差异的蛋白点(3倍或以上差异)。③基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱质谱鉴定选取蛋白并在UniProt和NCBInr数据库中进行肽质量搜索，明确它们可能是何种蛋白。(8)根据质谱鉴定结果对膜联蛋白A2蛋白的表达量的变化进行Westenl Blot实验验证。(9)体内杀伤实验：①免疫C57BL/6小鼠：将BMDC与HBc-VLPs共孵育24小时，用LPS诱导细胞成熟，将HBc-vLPs-BMDC(约3×106)皮下注射小鼠：②7天后，取正常C57BL/6小鼠脾细胞，HBc抗原肽刺激8小时后用5 nM5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(5(6)-CarboxyfluoresceinN-succinimidyl ester，CFSE)标记。用0.5 nM CFSE标记未经抗原肽刺激的淋巴细胞，将高、低浓度标记的淋巴细胞按1:1比例混合后(约3-4×107)，静脉注射给前期免疫的小鼠，12小时后，取脾脏，流式细胞仪检测，按下列公式计算CTL杀伤百分率：CTL％=(1-CFSEhigh/CFSElow)×100。(10)数据统计：所有数据均用Student's t-test进行统计分析。 结果：(1)原核表达系统pET28a-HBc重组质粒的蛋白表达、Ni-NTA亲和层析纯化：成功得到HBc蛋白。Western Blot实验证实了变复性后的蛋白能被抗HBc单抗所特异性地识别。电镜观察发现HBc蛋白能正确自主组装成蛋白颗粒，颗粒大小约22 nm。(2)小鼠BMDC的成功培养：光学显微镜观察证实体外培养BMDC的有DC的典型形态特征：流式细胞仪检测BMDC表面标志分子CD11c阳性表达率超过75％。(3)激光共聚焦显微镜观察到HBc-VLPs能快速、大量被BMDC吞噬，表明体外培养的BMDC有较强吞噬能力。(4)HBc-VLPs能诱导BMDC活化，提高其抗原提呈能力：流式细胞仪检测untreated-BMDC组、HBc-VLPs-BMDC组、LPS-BMDC组的表面标记分子CD86表达率分别为17-20％、42-45％、46-51％，CD80的表达率分别为16-17％、47-48.5％、56-58％，MHC-II分子的表达率分别为40-42.3％、63.5-68％、78-81％；RT-PCR结果证实HBc-VLPs-BMDC组IL-12和IFN-γ的mRNA水平明显高于untreated-BMDC组。(5)二维电泳检测负载HBc-VLPs前后BMDC细胞总蛋白谱的差异表达。通过ImageMasterTM软件对凝胶进行分析，每张凝胶上检到500-600个点，凝胶间匹配率大于70％。HBc-VLPs-BMDC组和DPBS-BMDC组凝胶之间有8个蛋白点显示3倍以上表达量差异。选取其中蛋白表达量较高的蛋白点6个，进行MALDI-TOF质谱鉴定，并在UniProt和NCBInr数据库中进行肽质量搜索，得到4个己知蛋白：Isocitrate dehydrogenase 3(NAD+)alpha、isoformCRA_e、growth factor receptor bound protein 2、similar toEpiplakin、annexin A2。以内参β-actin的表达量为参照，通过Western Blot验证发现BMDC在摄取吞噬HBc-VLPs后Annexin-A2表达量减少。(6)体内杀靶的方法验证HBc-VLPs负载的BMDC诱导特异性CTL活性：流式细胞仪检测荧光标记的细胞数，直方图显示靶细胞的百分比(M2)。在未处理组、PBS处理组、HBc-VLPs负载的BMDC组M2范围分别为46-49％、47-51％、17-19％。M2与被杀伤靶细胞的数量成反比，表明HBc-VLPs负载BMDC组可诱导高水平特异性CTL活性。 结论：(1)从大肠杆菌的包涵体成功获得了高纯度的HBc-VLPs。(2)形态学观察和细胞标志分子的检测表明在体外成功培养出小鼠骨髓源树突状细胞。(3)激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察证实，小鼠BMDC可在体外有效摄取HBc-VLPs；摄取后BMDC进一步成熟与活化细胞表面标志分子CD86、CD80、MHC-II表达增加，抗原提呈能力增强。(4)体内杀伤实验显示：用HBc-VlPs负载的BMDC免疫小鼠，可诱导产生抗原特异性T细胞应答，CTL活性增强。(5)二维电泳实验发现：HBc-VLPs-BMDC组和untreated-BMDC组的蛋白谱存在若干表达差异的蛋白点。(6)蛋白质谱分析出肽段，再从数据库进行肽质量搜索，得到4个己知蛋白Isocitratedehydrogenase 3(NAD+)alpha，isoform CRA_e、similar toEpiplakin、growth factor receptor bound protein 2、annexin A2。后2个蛋白在细胞的分化、增值、凋亡等过程中有重要的作用。(7)蛋白免疫印迹实验证实：与PBS-BMDC组相比，HBc-VLPs-BMDC组中蛋白膜联蛋白A2(Annexin-A2)的表达量减少，提示DC活化的抑制因素减少，而表现出增强DC生命力的作用，从而增强激活T细胞的能力。

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 以树突状细胞为基础的肿瘤疫苗设计策略的研究进展

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