酵母构象型随机肽库的构建及BAFF-R/TRAF3复合物解离肽的筛选

摘要

BAFF，又称BLyS，TALL-1，THANK，zTNF4或TNFSF-13B，是1999年发现的TNF家族成员。研究发现，BAFF能促进B细胞的存活和成熟，在体液免疫中发挥重要作用，BAFF过表达会导致自身免疫性疾病。BAFF有三个受体，分别为BCMA、TACI、BAFF-R／BR3。其中BAFF-R被认为是最主要的受体。BAFF-R介导细胞内的替代NF-~B途径，BAFF三聚体诱导BAFF-R在膜上聚集，通过募集TRAF3接头分子，激活NF．KB。以BAFF-R／TRAF3复合物为研究对象，筛选促BAFF-R／TRAF3解离的小肽，阻断BAFF-R介导的信号通路，可以为自身免疫性疾病的治疗提供新的靶点。研究工作的结果可概括为以下几个方面： (1)通过RT-PCR方法钓取BAFF-R胞内区和TRAF3C端258-568aa的cDNA片段，构建重组质粒pBD-BAFF-R和pAD-TRAF3-C，利用酵母双杂交验证了两者的相互作用。构建pM-BAFF-R和pVPl6-TRAF-C表达载体，共转染COS-7细胞，利用哺乳动物双杂交进一步验证了两者的相互作用。构建了一系列的TRAF3缺失突变体，利用酵母双杂交确定TRAF3的328~400aa，428~463aa．543-560aa参与了与BAFF-R的结合。 (2)以硫氧还蛋白(Trx)为骨架，在桥质粒pBD-BAFF-R条件型启动子PMET25的下游构建可诱导表达的酵母构象型随机lO肽库。利用PCR扩增出trx基因，通过重叠延伸PCR向trx的突环区引入AscI酶切位点，构建pBD-BAFF-R-mTrx重组载体。采用(NNK)10的编码方式设计并合成两条寡核苷酸链，经退火、延伸，AscI／RsrⅡ双酶切，克隆至pBD-BAFF-R-mTrx载体，电转化E．coliDHlOB感受态细胞。最终获得库容量为8.7×1O8的酵母构象型随机肽库；随机挑选20个克隆进行测序，4个核苷酸的出现频率与理论值接近；免疫印迹结果表明，在Met缺陷培养基中，随机肽库可被诱导表达，表明构建的肽库是成功的。 (3)解离肽的筛选及初步的功能研究，将构建好的pBD-BAFF-R文库质粒转化酵母细胞Y190(pAD．TRAF3-C)，挑选在三缺SD／-Trp／-Leu／-His培养基上生长良好，变蓝的菌落，接种在四缺SD／-Met／-Trp／-Leu／-His培养基上，选择不生长、不变蓝的菌落即为预期的阳性克隆。最终得到6个候选解离肽的阳性克隆。选取2条小肽(P1、P2)进行人工合成。初步的细胞学实验表明，Pl能特异性地抑制BAFF刺激外周血B淋巴细胞增生的活性。 (4)利用酵母三杂交系统，以BAFF-R胞内区／TRAF3复合物为诱饵，筛选人脾cDNA文库，获得新的TRAF3相互作用蛋白RIPK2，并利用哺乳动物双杂交进一步验证了两者的相互作用。 本研究以BAFF-R／TRAF3复合物为例，探讨了利用构建的酵母构象型随机肽库筛选促蛋白复合物解离的方法，获得的解离肽可阻断蛋白组份所介导的信号通路，对于治疗由于信号通路异常激活而导致的疾病有重要意义。此外，新的TRAF3相互作用蛋白RIPK2的获得，为深入理解BAFF-R受体信号通路，丰富人们对RIPK2功能的认识提供了新的线索。

目录

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引言

第一部分BAFF-R与TRAF3相互作用的研究

第二部分Trx为骨架构建可诱导的酵母构象型随机肽库

第三部分解离肽的筛选及初步功能研究

第四部分以BAFF-R/TRAF3复合物为诱饵筛选相互作用蛋白

总结

创新之处

参考文献

致谢

附录一英文缩略词对照表

附录二主要仪器设备

附录三溶液配制

文献综述

在学期间发表的论著：以Trx为骨架构建可诱导表达的酵母构象型随机肽库