培养细胞对糖代谢异常环境的基因应答研究

摘要

目的：通过研究体外培养细胞在严格控制的条件下对微环境内、外糖代谢基本物质含量变化的基因应答，深入探索发生在糖尿病视网膜病变中的糖生物学调控机制。方法：建立稳定的正常人二倍体成纤维细胞与各物种血管内皮细胞的无糖培养环境，为单因素分析实验打下基础；在模拟生理条件激活细胞膜糖转运系统后，精确改变培养环境内基本糖代谢物质以及关键中间产物的含量，了解上述细胞的生物学行为应答；运用DNA分子杂交原理与抑制性PCR技术构建样本间差异表达基因的cDNA克隆文库。结结论：高浓度的葡萄糖或其活性代谢产物对培养细胞产生的毒性作用与其对转录水平的调控有关，氨基己糖生物合成途径产物对糖尿病视网膜微血管并发症的出现具有很强的刺激能力，血管内皮细胞对毒性代谢产物的基因应答可能在糖网病的发生机制中占据核心地位。作为连接蛋白质翻译后乙酰胺糖基化修饰体系的底物合成和糖缀合物分解产物进入三羧酸循环产生能量之间的唯一调节通道，磷酸氨基葡萄糖脱氨旁路对保持能量代谢和糖生物学调节平衡具有重大意义。本研究结合编码基因抑制性消减杂交技术和糖尿病视网膜病变发病机制研究的最新进展，在已取得的实验结果基础上提出UDP-GlcNAc代谢池的阀门控制模式假设，为探索糖缀合物代谢与蛋白质翻译后修饰参与糖尿病视网膜病变的机制及新的诊治方法奠定基础。

目录

前言

第一部分正常人二倍体成纤维细胞及常见物种血管内皮细胞的无糖化培养

第二部分葡萄糖及其代谢衍生物对高严谨条件下培养细胞的刺激实验

引言

材料与方法

结果

讨论

第三部分用抑制性消减杂交技术克隆培养人血管内皮细胞差异表达基因

引言

实验方法与结果检验

一合成cDNA第一链

二合成cDNA第二链

三分离和沉淀cDNA

四消化逆转录产物

五衔接头连接cDNA片段

六连接效率的分析

七第一次差减杂交

八第二次差减杂交

九第一次PCR扩增

十第二次PCR扩增（巢式PCR）

十一PCR分析差减杂交效率

十二剿式PCR产物的纯化

十三PCR产物的T-载体连接并转化大肠肝菌

十四克隆选择与菌落PCR

讨论

参考文献

附录一：常用试剂与仪器

附录二：细胞培养基成分

附录三：在读期间论文发表情况

附录四：在读期间获得研究资助情况

附录五：在读期间获得学术奖励情况

附录六：文献综述 糖尿病视网膜病变的病理与发病机理

附录七：常用英文缩写表

后记

论文独创性声明及论文使用授权声明