慢病毒介导的RNA干扰抑制骨桥蛋白表达对肝癌细胞生物学行为的影响

摘要

肝细胞肝癌(简称肝癌)是世界上最常见、恶性度最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第6位、死因的第3位，在我国已成为恶性肿瘤的第2位死因。近几十年来尽管对肝癌的基础研究和诊断治疗都取的了显著进步，但肝癌的总体预后仍然很差，并没有显著的改善，5年生存率仅为5％左右。手术治疗仍是目前肝癌最有效的方法，但肝癌根治性切除后5年转移复发率高达60～70％，其远期疗效仍欠满意。术后转移复发已成为进一步提高肝癌疗效的主 第一部分 慢病毒RNAi载体的构建本部分的研究 目的：是构建慢病毒RNAi表达载体，并将其转染人高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3(原位接种5周后肺转移率为100％，皮下接种5周后肺转移率达100％)，并筛选、获得稳定转染细胞株。 结果：经测序证实插入的序列正确。构建的病毒滴度约为1×10<'8> TU/ml。本实验的MOI=30。得到稳定转染细胞株4个：LM3-Lemi．OPNi-1、LM3-Lemi．OPNi-2、LM3-Lenti．OPNi-4、LM3-Lenti．OPNi-3M。HCCLM3细胞感染病毒Lenti．OPNi-3后，单克隆集落形成能力及增殖力显著下降，无法得到可以传代的病毒感染细胞株。故在后续有关Lemi．OPNi-3感染细胞株皆采用高滴度(MOI=50)病毒感染一定数量的HCCLM3细胞制备，以确保95％以上的细胞GFP表达阳性。应用Real-Time PCR检测5种病毒对OPN表达的抑制率分别为Lemi．OPNi-1 60％、Lenti．OPNi-2 72％、Lenti．OPNi-3 90％、Lenti．OPNi-4 51％、Lenti．OPNi-3M 14％，Western blot检测进一步证实上述结果。选取Lemi．OPNi-2和Lenti．OPNi-3作为后续研究的主要对象。发现病毒感染后细胞P-elF2α表达水平无显著差异，提示Lemi．OPNi-3抑制肝癌细胞生长可能存在其它机制而非RNAi引起细胞的抗病毒反应。Lemi．OPNi-2对细胞增殖无显著影响。对照病毒Lenti．OPNi-3M对OPN表达无明显抑制作用。 结论：我们成功构建并筛选出具有较强的OPN表达抑制作用的慢病毒Lenti．OPNi-2和Lenti．OPNi-3。Lemi．OPNi-3转染可明显抑制HCCLM3细胞的克隆形成能力，且这种作用与RNAi导致的非特异性干扰素样诱导效应无关。Lenti．OPNi-2虽可抑制OPN表达，但对细胞克隆形成能力无显著影响。对照病毒Lenti．OPNi-3M对OPN表达和细胞增殖均无明显抑制作用。 第二部分 抑制OPN表达对肝癌细胞生物学特性的影响 一、OPN表达沉默对高转移潜能肝癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响 本部分的研究目的是观察OPN表达抑制后对肝癌细胞HCCLM3的增殖和侵袭能力的影响，并初步探讨其相关调控机制。 (1) OPN表达沉默对肝癌细胞增殖的影响第一部分研究发现 Lenti．OPNi-3 和 Lenti．OPNi-2的作用存在明显不同，为进一步验证和解释这一发现，我们用MTT实验检测Lenti．OPNi-3M、Lenti．OPNi-2、Lenti．OPNi-3 三组病毒转染对HCCLM3细胞增殖力的影响。结果显示与空白对照组(Mock)相比，Lenti．OPNi-3组细胞生长明显受抑(p<0.001)，而Lenti．OPNi-3M、Lenti．OPNi-2组细胞增殖力无显著改变(p=0．27，p=0．08)。 为进一步探讨其相关机制，我们采用Western blot检测细胞增殖相关的信号转导蛋白pMEK、pERK1/2的表达情况，结果显示Lenti．OPNi-3组细胞pERK1/2表达量明显下降(p<0.001)，而Lenti．OPNi-2和Lenti．OPNi-3M组pERK1/2无明显改变(p=0.218，p=0.482)。各组GAPDH、NF-κB等的表达量无显著差异。提示pERK1/2表达的下调是特异性的，OPN可能参与HCCLM3细胞MEK/ERK1/2信号通路的调节。 为了进一步验证这一推论，我们单用重组人OPN蛋白(10μM)或联合MEK抑制剂U0126(20μM)作用于稳定转染Lenti．OPNi-3的HCCLM3细胞，约20分钟后检测细胞pMEK、pERK1/2表达情况，发现单用OPN蛋白组pMEK、pERK1/2表达明显高于联合组(p<0.001)，提示OPN激活ERK1/2是通过pMEK信号途径。由于Lemi．OPNi-3组细胞pERK1/2下降明显、生长停滞，Lenti．OPNi-2对细胞增殖无明显影响，而两者对细胞OPN表达的抑制率不同(蛋白水平分别为95％和78％)，提示OPN可能参与HCCLM3细胞的增殖，并且要满足细胞增殖OPN的表达量不能低于基础表达量的5％(1-95％)。然而与Lenti．OPNi-3M比较，Lenti．OPNi-3 对 HepG2细胞(无转移潜能的肝癌细胞株)增殖影响无显著差异(p=0.216)，且Western blot显示pMEK和pERK1/2的表达也无差异(p=0.127)。类似的现象也见于病毒转染后的正常肝脏细胞CCL13。说明对于OPN低表达的HepG2、CCL13细胞，可能需要满足增殖所需的OPN量更少或根本就不需要，抑制OPN表达并不影响它们的正常生长。 上述结果表明，OPN参与HCCLM3细胞增殖相关的MAPK信号转导通路的调节，但是发挥这种增殖调节功能所需的基础OPN表达量很少，在HCCLM3细胞不能低于基础表达量的5％，在恶性度较低的HepG2细胞以及正常肝脏细胞甚至可能更少。这可能解释为什么一些研究结果显示抑制OPN表达对细胞的增殖没有影响，原因可能是即使剩余少量的OPN也足以满足增殖的需要。 (2) OPN表达沉默对肝癌细胞侵袭能力的影响 为进一步研究OPN与肝癌细胞侵袭转移的关系，我们应用Matrigel侵袭实验检测Lenti.OPNi-3M、Lenti.OPNi-2、Lenti.OPNi-3抑制OPN表达后，对HCCLM3侵袭力的影响。结果显示与空白对照组(28.8±2.6)相比，Lenti.OPNi-2(9.2±1.3)和Lenti.OPNi-3 (7.8±1.5)组的穿过人工基底膜的细胞数明显减少(p<0.001)，而Lenti.OPNi-2和Lenti.OPNi-3 两组差别无显著意义(p=0.152)。为进一步探讨其相关机制，Western blot检测了三组细胞OPN表达沉默后，基质降解酶MMP-2、uPA和MMP-9的表达，结果显示与空白对照相比，Lenti.OPNi-2和Lenti.OPNi-3两组细胞MMP-2、uPA表达显著下降(p<0.001)，而MMP-9表达无明显变化(p=0.067和p=0.099)。为进一步验证OPN与MMP-2的直接联系，我们分别用不同浓度的重组人OPN蛋白(10μM和20μM)刺激OPN表达沉默的HCCLM3细胞(Lenti.OPNi-3)，明胶酶谱法分析细胞培养基上清，发现MMP-2表达随着OPN浓度的升高而增加(p=0.003和p=0.002)。 上述结果显示Lenti.OPNi-2、Lenti.OPNi-3抑制HCCLM3细胞的侵袭转移可能与降低MMP-2和uPA的表达有关。Lenti.OPNi-2不影响HCCLM3细胞增殖，却能显著抑制HCCLM3侵袭转移。而Lenti.OPNi-3对HCCLM3细胞增殖和转移都具有显著抑制作用。这提示我们肿瘤细胞增殖和转移两种不同生物学行为对OPN蛋白的基础表达量可能存在不同量的要求。对于HCCLM3细胞，如果OPN蛋白表达量低于22％(1-78％)，侵袭转移将受限，而低于5％(1-95％)细胞增殖也受到抑制。可见侵袭转移较增殖对OPN蛋白表达下调更敏感，其详细机制有待探讨。另外，还发现对于HCCLM3细胞，OPN可能通过NF-κB信号途径调节MMP-2和uPA的表达。 二、OPN表达沉默对高转移潜能肝癌细胞成瘤和肺转移的影响 本部分的研究目的是采用裸鼠人肝癌肺转移模型进一步验证不同程度的抑制OPN表达对肝癌细胞HCCLM3的侵袭、增殖能力的影响。 我们分别将转染Mock、Lenti.OPNi-2、Lenti.OPNi-3的三组HCCLM3细胞(5×10<'6>/ 只)裸鼠皮下接种，6周后观察裸鼠的成瘤和肺转移。结果显示Lenti.OPNi-3 组裸鼠成瘤率(50％)明显低于Mock对照组和 Lenti.OPNi-2组(100％)，且肿瘤体积较小 (Lenti.OPNi-3 组为341±502.6mm<'3>，而Lenti.OPNi-2组为3686.9±2206.7 mm<'3>，Mock组为4423.6±1206.7 mm<'3>)(p<0.001)。采用活体荧光成像分析系统观察发现 Lenti.OPNi-3组没有成瘤的裸鼠在原接种部位仍然存在发荧光的肿瘤细胞，说明肿瘤细胞增殖非常缓慢，无法成瘤并非是由于RNA干扰可能导致的非特异性细胞毒性作用。 我们通过对裸鼠成瘤大小和肺转移率的检测，再次证实了体外实验的观察结果，进一步说明不同程度的沉默OPN表达对HCCLM3细胞的增殖和侵袭两种生物学行为的影响是不一样的，侵袭转移比增殖对OPN基础表达量的下调更为敏感。

目录

声明

前言

第一部分慢病毒RNAi表达载体的构建

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分抑制OPN表达对肝癌细胞生物学行为的影响

一、OPN表达沉默对高转移潜能肝癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响

材料和方法

统计学处理

结果

二、OPN表达沉默对高转移潜能肝癌细胞成瘤和肺转移的影响

材料和方法

统计学处理

结果

讨论

全文总结：

参考文献

文献综述 骨桥蛋白与肿瘤的演进

附件

致谢