纳米二氧化钛及其复合物在生物电化学领域中的应用

摘要

纳米TiO<,2>是一种n型半导体，具有很强的光催化效率。其发生光催化氧化作用的原理是：在紫外光(λ<390nm)照射下，TiO<,2>受到光激发形成光生空穴-电子对。在空间电场的作用下，空穴可以与电子发生分离，并分别与水和溶解氧作用生成OH·、H<,2>O2和HO<,2>·等活性氧类。这些活性氧类与有机物、细菌、病毒和细胞等发生光催化氧化作用，从而分解有机物和杀灭生物体。纳米TiO<,2>因具有独特的光催化氧化能力以及无毒、化学性质稳定、成本低等优点而被广泛应用于涂料、生物医学、环境工程等很多方面。 癌症是当今世界威胁人类健康的大敌，癌症发病率的不断提高要求研究人员不断地寻找新颖且有效的治疗方法，纳米TiO<,2>光催化杀伤癌细胞是一种新的探索中的治疗癌症的方法。已有的研究成果证明，纳米TiO<,2>有望成为能有效治疗癌症且对人体毒副反应小的光敏药物，所以探索纳米TiO<,2>对癌细胞的光催化杀伤作用具有理论意义和实用价值。但是目前纳米TiO<,2>用于光催化杀伤癌细胞的研究还较少，还有一些问题需要做进一步的研究和探索。其不足之处表现为：(1)纳米TiO<,2>表面光生电子一空穴对的复合几率较高，其光催化杀伤癌细胞的效率还较低，需要较大浓度的纳米TiO<,2>，但是过高浓度的光敏剂不适宜用于人体治疗；(2)正常细胞在紫外光照下也可以被纳米TiO<,2>杀死，所以需要通过提高纳米TiO<,2>对肿瘤细胞的“靶向性”吸附能力来增强其对肿瘤细胞的杀伤效果，减少其对正常细胞的副作用。为了克服上述缺点，本论文采用化学修饰的方法来提高纳米TiO<,2>光催化杀伤癌细胞的效率和选择性。同时还研究了纳米TiO<,2>及其复合物在生物电化学领域中的其它用途，主要研究内容有： 1．采用沉积-沉淀法(DP)和硼氢化钠还原法合成了Au纳米粒子修饰的P25TiO<,2>(Au/P25)和Au纳米粒子修饰的锐钛矿型TiO<,2>(Au/锐钛矿TiO<,2>)，首次深入探讨了Au纳米粒子修饰后纳米TiO<,2>对癌细胞的杀伤作用。实验结果表明：沉积-沉淀法和化学还原法均可实现Au纳米粒子在TiO<,2>样品表面的均匀沉积；黑暗中TiO<,2>纳米粒子和Au/TiO<,2>纳米复合物对LoVo细胞几乎没有毒性；在紫外光激发下，纳米TiO<,2>(P25或锐钛矿型)可以通过光催化氧化作用对LoVo细胞产生杀伤作用，而且锐钛矿型TiO<,2>对LoVo细胞的杀伤效果明显比P25 TiO<,2>更好；Au沉积能有效提高纳米TiO<,2>的光催化效率。当加入50 μg/mL的P25TiO<,2>或锐钛矿TiO<,2>时，紫外光(光强1.8 mW/cm<'2>)照射100min后，分别有40％和60％的I．oVo细胞被杀死。当加入50μg/mL的2wt％Au/P25 TiO<,2>和2 wt％Au／锐钛矿TiO<,2>时，紫外光(1.8 mW/cm<'2>)照射100min后，杀伤LoVo细胞分别达到100％和93％。而且Au沉积对光催化效率的提高效果受到沉积量的控制，Au的最佳沉积量为2％：从机理上分析，Au/TiO<,2>对癌细胞光催化杀伤的作用主要来源于紫外光激发下Au/TiO<,2>表面生成的活性物种羟基自由基(·OH)。 2．首次将癌胚抗原单抗与纳米TiO<,2>粒子进行结合，提出利用癌胚抗原单抗与肿瘤细胞的特异性结合将纳米TiO<,2>粒子导向癌细胞表面，再利用电穿孔的方法促使它们进入癌细胞中，然后用紫外光照射，使TiO<,2>纳米粒子在癌细胞内部产生光催化氧化作用杀死癌细胞。紫外一可见吸收光谱和荧光光谱证明了抗体在纳米TiO<,2>表面的吸附，共聚焦荧光显微镜图像表明了抗体-纳米。TiO<,2>复合物与LoVo癌细胞的选择性结合。而细胞毒性实验结果显示：无光照下纳米TiO<,2>悬浮液对LoVo癌细胞和正常。TE353．sk细胞均无明显的细胞毒性；在紫外光(强度为4mW/cm<'2>)照射60分钟后，仅用纳米TiO<,2>时对LoVo细胞的杀死率为47％，而用抗体-纳米TiO<,2>复合物时癌细胞的死亡率上升为61％；当抗体-纳米TiO<,2>复合物结合了电穿孔技术后，具有最高的癌细胞杀伤效率和选择性，紫外灯(强度1.8 mW／cm<'2>)光照90 min后，LoVo癌细胞全部被杀死，而正常TE353．sk细胞仍然有61％的存活率。综上所述，本论文利用抗原和抗体之间的特异性反应和电穿孔技术实现了纳米TiO<,2>粒子与癌细胞的选择性结合，提高了纳米TiO<,2>粒子对癌细胞的光催化杀伤效应。 3．以三嵌段高分子非离子表面活性剂(EO<,20>PO<,70>EO<,20>，P123)为结构导向剂，采用模板组装法合成了孔径分布均一、比表面积高的有序介孔二氧化钛材料，并以大肠杆菌(E．coli)为实验对象，首次研究了该有序纳米介孔TiO<,2>对大肠杆菌的光催化杀菌效应。实验结果表明：合成的介孔TiO<,2>具有较大的孔径(约6.5nm)，且孔径分布较窄、比表面积(BET)为208m2/g，约为无表面活性剂时合成的TiO<,2>(50m<'2>/g)的四倍；制备的有序介孔纳米TiO<,2>材料具有良好的光催化杀菌效应，光照60分钟后，大肠杆菌的存活率仅为10％，光照120min后，大肠杆菌的存活率几乎为零；随着有序介孔纳米TiO<,2>量的增加，对大肠杆菌的杀死效率也提高；在一定的菌液浓度条件下，存在一个发挥杀菌效率最佳的TiO<,2>量，本实验中TiO<,2>的最佳浓度为1mg/ml。 4．采用沉积．沉淀法合成了Au负载量为8 wt％的Au纳米粒子修饰的纳米TiO<,2>复合物(AuNP-TiO<,2>)，并将其应用于固定辣根过氧化物酶(HRP)，考察利用Au纳米粒子修饰的纳米TiO<,2>复合物加速HRP与玻碳电极之间的直接电子传递行为，探索研制非媒介体型的过氧化氢传感器。实验结果表明：当纳米TiO<,2>用Au纳米粒子修饰后，电极的反应电阻大大下降，TiO<,2>/GC电极的反应电阻为1548 O，而AuNP-TiO<,2>/GC电极的反应电阻为1134 O；Au在纳米TiO<,2>上的修饰提高了HRP的电化学响应，HRP/AuNP-TiO<,2>/GC电极的氧化还原峰电流大于HRP/TiO<,2>/GC电极的峰电流；HRP/AuNP-TiO<,2>/GC电极中的HRP对过氧化氢具有较强的催化作用，对H<,2>O<,2>具有快速地电流响应，能在小于2秒的时间内达到95％的稳态电流；HRP/AuNP-TiO<,2>/GC电极具有较小的表观米氏常数K<'app><,M>(234/μM)，说明固定在AuNP-TiO<,2>膜中的HRP显示了较高的酶催化活性和对过氧化氢的高亲和力；HRP/AuNP-TiO<,2>/GC电极的重现性较好，对浓度为200μM过氧化氢连续测试6次，其相对标准偏差(R．S．D．)为4.3％。 5．初步尝试以高压汞灯作为紫外线的光源，以纳米TiO<,2>溶胶作为载体，采用简便的紫外光还原法制备了纳米Au/TiO<,2>复合半导体粒子。用紫外一可见光谱，SEM和XRD进行了表征，证实了纳米Au粒子的形成，并采用提拉法将此复合溶胶固定在ITO基底上制备成薄膜，测量纳米Au/TiO<,2>复合膜电极的光电流，考察纳米Au/TiO<,2>复合膜的光电化学性质。实验结果表明：光电流起于345 nm，并在360 nm波长时光电流达到峰值，然后光电流值开始减小，当波长达到395nm时，光电流会变得较弱；纳米Au/TiO<,2>电极的光电流值明显大于没有修饰纳米Au的TiO<,2>电极，当光的波长为360nm时，纳米TiO<,2>膜电极的光电流值为23nA/cm<'2>，而纳米Au/TiO<,2>复合膜电极的光电流为37 nA/cm<'2>。总体来说，纳米Au的修饰能显著提高TiO<,2>电极光电响应，从而提高TiO<,2>电极的光电转换效率。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第一节纳米TiO2的研究进展

1.1.1纳米TiO2的合成方法

1.1.2纳米TiO2光催化作用的机理

1.1.3 TiO2光催化技术存在的科学技术难题

1.1.4提高TiO2多相光催化活性的途径

第二节纳米TiO2作为光敏剂在光动力学疗法中的应用

1.2.1光动力学疗法概述

1.2.2光动力疗法基本原理

1.2.3光动力学作用的两种反应机制

1.2.4影响光动力学疗法的因素

1.2.5光敏剂的特征及光敏剂的发展

1.2.6肿瘤细胞内药物的靶向传递

1.2.7 TiO2光催化氧化杀灭肿瘤细胞的研究进展

1.2.8纳米TiO2光催化杀灭癌细胞技术存在的问题

1.2.9电穿孔技术

第三节TiO2光催化杀菌

1.3.1 TiO2光催化氧化杀菌的研究进展

1.3.2TiO2光催化氧化杀菌的机理

1.3.3 TiO2光催化抗菌材料性能的提高

1.3.4纳米TiO2与其它无机抗菌剂的比较

第四节纳米TiO2粒子在生物传感器中的应用

1.4.1生物电化学简介

1.4.2蛋白质直接电化学研究综述

1.4.3用于固定蛋白质/酶的纳米材料

1.4.4蛋白质/酶在纳米TiO2上的固定

1.4.5辣根过氧化物酶(HRP)的性质

第五节纳米TiO2光催化材料在太阳能电池中的应用

1.5.1纳米TiO2太阳能电池概述

1.5.2纳米TiO2薄膜的制备方法

1.5.3纳米TiO2电极的修饰

第六节本论文的研究工作

参考文献

第二章实验试剂及体外细胞培养

第一节实验主要试剂及实验仪器

2.1.1实验试剂

2.1.2实验仪器

第二节测试方法

2.2.1物理性质的表征方法

2.2.2电化学性能表征

第三节体外细胞培养

2.3.1引言

2.3.2细胞株

2.3.3细胞培养相关液体的配制

2.3.4体外培养人细胞生长的条件

2.3.5培养细胞的实验步骤

2.3.6细胞的运送

2.3.7贴壁细胞的传代培养

2.3.8培养细胞的常规观察

2.3.9细胞的冻存

2.3.10细胞的复苏

2.3.11细胞计数法

第四节细胞活力的检测方法

2.4.1台盼蓝排斥试验

2.4.2集落形成试验

2.4.3四唑盐比色试验

2.4.4碘化丙啶荧光染色法

2.4.5流式细胞仪检测

参考文献

第三章Au改性纳米TiO2粒子的制备及其对人结肠癌细胞的光催化活性

第一节Au改性纳米TiO2粒子的制备及表征

3.1.1实验部分

3.1.2结果与讨论

第二节波长为365nm的紫外光照下纳米TiO2和Au/TiO2对癌细胞的光催化杀伤作用

3.2.1实验部分

3.2.2结果与讨论

第三节波长为253.7nm的紫外光照下纳米TiO2和Au/TiO2对癌细胞的光催化杀伤作用

3.3.1实验部分

3.3.2结果与讨论

3.3.3本章小结

参考文献

第四章结合电生孔技术的抗体-纳米TiO2靶向光敏杀癌细胞

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1纳米TiO2悬浮液的制备

4.2.2抗体-纳米TiO2复合物的制备

4.2.3细胞培养

4.2.4实验设计和处理

4.2.5细胞存活率的测定

4.2.6纳米TiO2光催化对癌细胞内DNA的杀伤作用

4.3结果与讨论

4.3.1纳米TiO2的TEM图

4.3.2抗CEA抗体与纳米TiO2粒子的结合

4.3.3FITC标记抗体-纳米TiO2复合物与LoVo癌细胞的选择性结合

4.3.4黑暗中纳米TiO2对细胞存活率的影响

4.3.5紫外灯光照下纳米TiO2对癌细胞和正常细胞存活率的影响

4.3.6紫外光激发下抗体-纳米TiO2复合物对癌细胞的作用

4.3.7紫外光激发下抗体-纳米TiO2复合物正常细胞的作用

4.3.8电穿孔技术对癌细胞存活率的影响

4.3.9不同实验条件对结肠癌细胞的光催化氧化杀伤结果

4.3.10抗体-纳米TiO2复合物+电穿孔和紫外光照复合技术对细胞杀伤能力的选择性

4.3.11纳米TiO2光催化对癌细胞内DNA的杀伤作用

4.4本章小结

参考文献

第五章有序介孔TiO2材料的光催化生物杀菌效应研究

5.1引言

5.2实验部分

5.2.1有序介孔TiO2材料的制备和表征

5.2.2大肠杆菌的培养和光催化杀菌过程

5.3结果与讨论

5.3.1样品的形貌和结构表征

5.3.2介孔TiO2的光催化杀菌作用

5.3介孔TiO2的光催化杀菌机理讨论

5.4本章小结

参考文献

第六章基于纳米金修饰的二氧化钛上的HRP的固定及其生物电化学

6.1引言

6.2实验部分

6.2.1采用沉积-沉淀法(DP法)合成纳米Au/P25 TiO2

6.2.2制备HRP/AuNP-TiO2/GC电极

6.2.3电化学仪器与方法

6.3结果与讨论

6.3.1TiO2纳米粒子和AuNP-TiO2纳米复合物的TEM图

6.3.2AuNP-TiO2/GC电极的电化学阻抗研究

6.3.3基于AuNP-TiO2的HRP的直接电化学

6.3.4 pH值对循环伏安行为的影响

6.3.5 HRP/AuNP-TiO2/GC电极对过氧化氢的电催化作用

6.3.6 HRP/AuNP-TiO2/GC电极的稳定性

6.4本章小结

参考文献

第七章光还原法制备纳米Au/TiO2复合粒子及其光电化学性质研究

7.1引言

7.2实验部分

7.2.1纳米Au/TiO2复合电极的制备

7.2.2光电流测试

7.3结果与讨论

7.3.1紫外可见吸收光谱

7.3.2 SEM照片

7.3.3 X射线衍射(XRD)谱图

7.3.4光还原形成机理研究

7.3.5纳米Au/TiO2复合电极的光电响应研究

7.3.6纳米Au/TiO2复合电极的光电响应机理探讨

7.4本章小结

参考文献

第八章本论文的工作总结及创新点

攻读博士学位期间科研成果

致谢