人脯氨酸异构酶CYPJ的功能探讨及其与CYPA的小分子抑制剂筛选

摘要

亲环素蛋白(cyclophilin，CYP)属于脯氨酸异构酶(PPIase)超家族，能够催化脯氨酰多肽和脯氨酰蛋白的顺反结构互变，其活性能够被免疫抑制剂环孢菌素A(CsA)抑制。亲环素蛋白在植物、细菌、昆虫、真菌和哺乳动物中广泛存在，并且在进化中具有高度的结构保守性。随着对亲环素家族成员功能研究的不断深入，越来越多的证据表明亲环素成员在细胞调亡、肿瘤、炎症、病毒感染等病理过程中都发挥着重要作用。 通过电子差异显示分析，本实验室鉴定到一条肝癌上调表达cDNA。序列分析表明，这是一个新的亲环素家族成员。经国际基因命名委员会(HUGO)确认，该基因被命名为cyclophilin J(CYPJ)。通过测试CYPJ在56对肝癌/癌旁组织样品中的表达量，我们发现CYPJ基因的mRNA在71.42％的肝癌组织中上调表达。原核表达的CYPJ蛋白具有脯氨酸异构酶活性(PPIase)，并且其活性能被CsA抑制。CYPJ过量表达可以促进L02和SK-Hepl细胞的克隆形成，而CYPJ稳定表达细胞株裸鼠皮下移植瘤的生长速度也较对照加快。本文在这些研究的基础之上对CYPJ与肝癌的相关性做了进一步的研究。用携带靶向CYPJ短发卡状RNA(sh-RNA)的慢病毒感染肝癌细胞、敲减CYPJ表达之后，体外和在体实验结果均显示肝癌细胞生长速度较对照减慢。CYPJ促肿瘤增殖的机理可能在于它对细胞周期的调节：CYPJ过表达可以引起细胞G<,1>期减少，S期增加；相反，用siRNA敲减CYPJ的表达或者用CsA处理细胞后则引起细胞G<,1>期增加，S期减少。这表明CYPJ能够促进细胞周期由G<,1>期向S期的转变。无论是在mRNA水平还是蛋白质水平，CYPJ过表达后cyclin D1基因均被上调，而用siRNA敲减CYPJ表达或者用CsA处理细胞均能降低cyclin D1的表达量。我们用双荧光素酶报告系统研究了CYPJ对cyclin D1启动子的转录调控，结果显示CYPJ能够激活cyclinD1的的启动子，并且这种激活依赖于其PPIase活性。进一步的分析表明，CYPJ对cyclin D1的转录调控可能由多条转录因子的信号通路来介导。 亲环素家族成员在许多病理过程中都发挥作用，因此筛选亲环素的抑制剂是目前药物研发的一个方向，有望从中开发出具有抗病毒、消炎、抗肿瘤活性的小分子化合物。本文基于CYPA/CYPJ的晶体结构，通过计算机虚拟筛选，从SPECS数据库中得到了若干CYPA/CYPJ的小分子配体。接着利用BIACORE分子相互作用分析仪，实验验证了这些小分子化合物与CYPA/CYPJ的亲和性，并进一步通过α-胰凝乳蛋白酶法检测了小分子化合物对CYPA/CYPJ的酶活抑制能力。最终我们确定了12个具有PPIase抑制能力的小分子配体。测定了这些小分子配体对HIV-1病毒的抑制作用，当用量为10 μM时，FD5，FD8，FD9，FD10和FDl2对HIV-1病毒的抑制能力均高于50％。这些化合物的抗HIV能力与它们的PPIase抑制能力相关，也与它们对CYPA的亲和性相关。同时，也测定了化合物FDl2对肝癌细胞株增殖的抑制作用。 本论文用RNAi敲减CYPJ表达，以及用CsA抑制其活性均能抑制肝癌细胞的生长，证明CYPJ是一个具有促肿瘤增殖活性的蛋白；也发现CYPJ能够促进细胞周期由G<,1>向S期转变，其机制与CYPJ对cyclin D1的表达调控有关。该研究为深入探讨肝癌的发病机制提供了有价值的候选基因，也为发展新的肝癌诊疗方法提供了新的思路。根据CYPA和CYPJ的晶体结构筛选和鉴定了若干小分子抑制剂，其中5个化合物能够显著抑制HIV-1病毒增殖，1个化合物具有抗肿瘤活性。这些抑制剂的发现为我们研究CYPs在病毒复制和肿瘤发生中的机理提供了新的手段，并且可以作为先导化合物进行结构优化和改建，为进一步开发更有效的抗病毒和抗肿瘤化合物奠定了良好的基础。

目录

论文说明：论文中用到的缩写

声明

第一章人脯氨酸异构酶CYPJ促进肝癌细胞增殖的研究

前言

材料与方法

一.材料和试剂

二.主要的仪器设备

三.生物学信息途径及统计方法

四.技术路线和实验方法

实验结果

一.应用RNAi敲减技术分析CYPJ对肝癌细胞生长的影响

二.CsA对肝癌细胞生长的抑制作用

三.CYPJ的细胞内定位

四.CYPJ对细胞周期的影响

五.CYPJ对cyclin D1表达的调控

讨论

参考文献

第二章CYPA与CYPJ小分子抑制剂的筛选及其生物活性研究

前言

材料与方法

一.材料和试剂

二.主要的仪器设备

三.生物信息分析途径和计算机分析软件包

四.技术路线和实验方法

实验结果

一.CYPA和CYPJ重组蛋白的制备

二.CYPA及CYPJ蛋白与小分子化合物的互作分析

三.小分子配体的酶活抑制分析

四.小分子配体的抗HIV-1活性

五、化合物FD12对肿瘤细胞增殖的影响

讨论

参考文献

小结

附录1

附录2

附录3

致谢