小鼠中RNA干扰负调控机制初探及RNA干扰在肿瘤治疗应用中的初步研究

摘要

小鼠中RNA干扰负调控机制初探及RNA干扰在肿瘤治疗应用中的初步研究 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是广泛存在于各种生物中，在进化上非常保守的一种转录后基因表达沉默的机制。随着RNA干扰技术的不断发展，大量的研究小组将RNA干扰作为高效实用的工具来对基因功能、信号传导通路以及疾病的发生机制进行研究。但是对于RNA干扰的调节机制却研究的很少，虽然有一些可以调控RNA干扰信号的蛋白质已经被鉴定并进行了功能的探讨。针对以前的一些研究工作我们进行了调查和整理，利用大肠杆菌发酵制备esiRNA(Ecoli expressed and enzyme digested siRNA)，在哺乳动物细胞体系和动物体系中进行了RNA干扰负调控机制的初步研究；继而使用两种esiRNA针对两个靶位以联合给药的方式分别在细胞实验和动物实验中抑制了小鼠黑色素瘤细胞的生长。本论文首先发现大剂量的esiRNA进入体内后，干扰HBV病毒复制的效率反而不如剂量小的esiRNA，并且发现esiRNA进入细胞后会诱导一系列负调控RNA干扰的基因表达的上调，如eri-1基因和adar-1基因。使用RNA干扰技术下调eri-1基因的表达水平后， RNA干扰的效果得到了有效改善。进一步我们使用不同剂量的C-myc esiRNA(针对小鼠c-myc基因的esiRNA，esiC-myc)抑制B16黑色素瘤细胞的生长，也遇到和前面工作相同的现象。高剂量esiRNA干扰的效果不佳，因此我们同时引入eri-1基因和adar-1，基因的esiRNA后改善了高剂量esiRNA干扰的效果。通过对RNA干扰负调控机制的研究，我们选用适当剂量的esiRNA分别使用一种esiRNA单独给药或两种esiRNA联合给药的方法在细胞实验和动物实验中抑制肿瘤细胞的生长。与一种esiRNA单独给药相比，两种esiRNA联合给药更能有效地抑制肿瘤的生长，延缓肿瘤生长的速度。 在第一部分的工作中，以乙肝病毒表面抗原hbs(Hepatits B virussurface antigen)基因作为报告基因，使用不同剂量的esiRNA分别转染到哺乳动物细胞或注射到小鼠体内。观察随着时间的变化不同剂量的esiRNA对HBsAg表达下调的变化。实验结果显示，使用尾静脉液压法将esiRNA注射到小鼠体内后，在高剂量的esiRNA注射小鼠的实验组中，靶基因的表达没有得到更好的下调，反而出现了上调。而且检测到小鼠meri-1基因(编码核博士论文：小鼠中RNA干扰负调控机制初探及RNA干扰在肿瘤治疗应用中的初步研究酸外切酶)和madar-1基因(编码RNA特异性的脱氨酶)mRNA水平的上调。使用RNA干扰下调meri-1基因的表达，可以增强RNA干扰对HBsAg表达抑制的敏感性和效率。我们的实验结果证明，当siRNA进入细胞后执行RNA干扰任务时，随着siRNA使用剂量的增加会诱导一系列负调控RNA干扰的基因表达，如表达出可以降解siRNA的核酸酶。因此，我们在利用siRNA进行基因功能研究和治疗疾病药物开发时，在siRNA剂量的使用方面应该多加斟酌。 在第二部分的工作研究中，将不同剂量的esiC-myc通过腹腔注射到接种了B16黑色素瘤的C57BL6/6J小鼠的体内，希望利用RNA干扰技术下调c-myc基因的表达后抑制小鼠体内的肿瘤生长。实验结果达到了我们的预期目的，然而也得到了一个意外的结果。在高剂量esiRNA治疗组中(>10μg/mouse/day)，肿瘤抑制率没有低剂量esiRNA治疗组的高。10 μg esiRNA治疗组(10 μg/mouse/day)达到了最好的肿瘤抑制率。考虑到我们在第一章工作中曾经研究发现eri-1和adar-1基因具有负调控RNA干扰的作用，因此引入eri-1基因和adar-1基因的esiRNA后，结果RNA干扰的效果得到了有效改善。如果同时将esiMERI-1(针对小鼠eri-1基因的esiRNA，10LLWmouse/day)和esiMADAR-1(针对小鼠adar-1基因的esiRNA，10μg/mouse/day)与高剂量esiC-myc(30 μg/mouse/day)一同给药后，小鼠肿瘤的生长抑制最好。实验结果证明，esiMERI-1和esiMADAR-1的引入，增强了esiC-myc抑制小鼠黑色素瘤生长的效应。因此我们推断，在使用RNA干扰技术应用于人肿瘤药物开发时，为了实现最好的药物治疗效果我们应该适当下调eri-1和adar-1基因在人类中同源类似物的表达。 第三部分的工作基于前面第一、二部分中对RNA干扰负调控机制的研究，调整好合适的esiRNA的剂量后，分别使用一种esiRNA单独给药或两种esiRNA联合的方法分别在细胞实验和动物实验中抑制肿瘤细胞的生长。实验结果显示，esiC．myc和esiSTAT3(针对小鼠stat3基因的esiRNA)联合给药的作用效果与esiC-myc或esiSTAT3单独给药的作用效果相比，两种esiRNA联合给药更能有效地抑制肿瘤的生长，延缓肿瘤生长的速度。通过RNA干扰同步下调c-myc和stat3基因的表达可以更有效地抑制小鼠黑色素博士论文：小鼠中RNA干扰负调控机制初探及RNA干扰在月中的衩步研究RNA干扰同步下调c-myc和stat3基因的表达可以更有效地抑制小鼠黑色素瘤的生长。制备针对多个靶位点的多种siRNA的新型药物的开发有可能为人类恶性疾病的治疗带来新希望。综上所述，我们的实验结果为RNA干扰负调控机制的研究补充了必要的数据，也为未来RNA干扰的应用研究提供了重要的基础信息。

目录

论文说明：缩略词

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摘要

综述 RNAi原理、机制调节及其应用

第一章高剂量的esiRNA导致RNA干扰效率降低的初步研究

1.摘要

2.前言

3.材料与方法

4.结 果

5.讨 论

参考文献

第二章不同剂量C-mycesiRNA对小鼠肿瘤生长抑制的影响

1.摘要

2.前言

3.材料与方法

4.结 果

5.讨 论

参考文献

第三章同步下调c-myc和stat3基因的表达对小鼠肿瘤生长的影响

1.摘要

2.前言

3.材料与方法

4.结 果

讨 论

参考文献

总结和展望

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