SARS冠状病毒N蛋白致不同年龄段小鼠急性肺损伤的早期免疫反应异同的研究

摘要

目的:SARS是新出现的一种具有很强传染性的呼吸道疾病，现已经确定其病原体是一种新型的冠状病毒。目前对其发病机制还了解很少，因此临床还缺乏特异有效的治疗手段。众多的研究表明SARS在儿童中的临床表现并不像成人那样严重，整个疾病发展过程也相对较为平缓。这种差异是否与SARS本身的发病机理以及人体对病原体的免疫反应有关仍有待论证，本研究旨在以SARS冠状病毒N蛋白复制小鼠肺部炎症模型，通过观察不同年龄组在SARS病毒蛋白所致肺部炎症损伤中的早期免疫反应的异同，为进一步探讨其发病机制的区别提供实验依据。 方法:(1)SARS肺炎动物模拟模型的建立。小鼠经鼻内滴入SARS病毒N蛋白溶液(0.5mg/ml)复制小鼠SARS肺部炎症模型。将不同年龄段(4周龄、6周龄、10周龄)的小鼠分别随机分为给药后2小时生理盐水对照组(XWC2)、给药后2小时病毒蛋白实验组(XWE2)、给药后6小时生理盐水对照组(XWC6)、给药后6小时病毒蛋白实验组(XWE6)、给药后24小时生理盐水对照组(XWC24)、给药后24小时病毒蛋白实验组(XWE24)等6组。 (2)标本的采集和检测。对各组小鼠的外周血、肺组织进行细胞学、病理学研究，测定肺组织湿/干重比(W/D)。利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清及肺组织匀浆中的TNF-α及IFN-γ浓度，并用Lowry氏法对肺组织匀浆的蛋白进行定量。(3)统计学方法。用SPSS 13.0统计软件，变量以均数±标准差(mean±SD)表示，多组计量资料间比较采用one-way ANOVA分析及SNK检验分析，两组间均数的比较采用t检验，以p<0.05表示有统计学意义。 结果:(1)外周血白细胞计数：①6周龄病毒蛋白组在给药后2小时白细胞总数(6.07±2.38)与生理盐水对照组(2.97±1.47)相比有显著上升，P<0.05。②不同年龄组之间病毒蛋白组较对照组差异变化百分比：给药后2小时，6周龄外周血白细胞总数上升幅度明显高于4周龄及10周龄小鼠，P<0.05，给药后24小时，4周龄及6周龄的外周血白细胞总数略有下降，但在10周龄中却显著上升，其变化幅度有统计学差异，P<0.05。(2)肺脏W/D：①10周龄组吸入N蛋白24小时后W/D(5.31±0.36)与生理盐水对照组(4.66±0.25)相比有显著上升，P<0.05。②不同年龄组之间病毒蛋白组较对照组差异变化百分比：给药后24小时，10周龄小鼠肺湿重/干重比值上升幅度明显高于4周及6周龄小鼠，P<0.05。(3)TNF-α：①外周血TNF-α：4周龄病毒蛋白组在吸入N蛋白6小时后外周血TNF-α含量(43.08±7.54)较生理盐水对照组(32.87±3.82)有显著上升，P<0.05；给药24小时后，10周龄病毒蛋白组(41.40±4.66)相比对照组(28.32±4.53)有显著上升，P<0.05。②不同年龄组之间病毒蛋白组较对照组外周血TNF-α差异变化百分比：给药后6小时，6周龄及10周龄外周血TNF-α含量略有下降，而4周龄中却显著上升，P<0.05；给药后24小时，10周龄组的上升幅度显著高于4周龄及6周龄组，P<0.05。③肺组织匀浆TNF-α：4周龄病毒蛋白组在吸入N蛋白6小时后肺匀浆TNF-α(279.0±17.7)较生理盐水对照组(337.1±43.3)有显著下降，P<0.05；6周龄病毒蛋白组在给药后2小时(416.6±41.7)，6小时(390.3±70.7)及24小时(447.0±24.7)肺匀浆TNF-α含量分别较2小时对照组(281.2±53.2)、6小时对照组(202.6±35.6)、24小时对照组(397.5±29.8)有显著上升，P<0.05。④不同年龄组之间病毒蛋白组较对照组肺匀浆TNF-α差异变化百分比：给药后2小时，6周龄组肺匀浆TNF-α含量的上升幅度显著高于4周龄组，P<0.05；给药后6小时，6周龄组肺匀浆TNF-α进一步上升，其幅度显著高于4周龄及10周龄组，且同时，10周龄组肺匀浆TNF-α上升幅度也明显高于4周龄组，P<0.05。(4)IFN-γ：①外周血IFN-γ：给药后6小时，6周龄病毒蛋白组外周血IFN-γ(23.56±5.85)较对照组(33.99±6.56)有显著下降，P<0.05；给药后24小时，4周龄病毒蛋白组外周血IFN-γ(27.61±4.93)较对照组(35.12±2.47)有显著下降，P<0.05，而10周龄病毒蛋白组外周血IFN-γ(28.89±3.78)却较对照组(21.22±4.01)显著上升，P<0.05。②不同年龄组之间病毒蛋白组较对照组外周血IFN-γ差异变化百分比：给药后6小时，4周龄组外周血IFN-γ上升幅度明显高于6周龄组，P<0.05；给药后24小时，6周龄及10周龄组外周血IFN-γ上升幅度明显高于4周龄组，P<0.05。③肺匀浆IFN-γ：6周龄(298.9±26.1)及10周龄(225.0±22.2)病毒蛋白组肺匀浆IFN-γ含量在给药24小时后分别较6周龄对照组(213.3±35.0)、10周龄对照组(153.5±39.9)有显著上升，P<0.05。④不同年龄组之间病毒蛋白组较对照组肺匀浆IFN-γ差异变化百分比：给药后24小时，6周龄及10周龄组肺匀浆IFN-γ上升幅度显著高于4周龄组，P<0.05。(5)肺组织病理：4周龄小鼠吸入N蛋白2小时后即有肺泡间隔增宽，毛细血管扩张充血和炎症细胞浸润，6小时后病变较前有所改善，但在给药后24小时病变再次加重，并伴有轻度水肿；6周龄小鼠吸入N蛋白2小时后肺泡间隔亦明显增宽，并伴有充血和炎症细胞浸润，给药后6小时病变达到高峰，伴有水肿，后肺组织病变有明显好转：10周龄小鼠吸入N蛋白2小时肺组织病理改变不明显，随着时间的延长病变较前逐渐加重，到了24小时还伴有明显的充血、水肿。 结论:(1)SARS冠状病毒N蛋白溶液可致小鼠急性肺损伤，表现为间质性病变为主的炎症改变，其肺部炎症反应与促炎症因子释放，Th1/Th2型细胞因子免疫自稳平衡失调有关。(2)空间上，幼龄鼠早期以一过性轻度全身炎症反应为主；青少年鼠早期以一过性肺脏局部炎症反应为主；成年鼠早期则先以肺脏局部炎症为主，后转为全身炎症反应。(3)时间上，幼龄鼠早期出现肺损伤时间最早，但缓解后又再次加重；青少年鼠早期出现肺损伤时间较幼龄鼠晚，后亦有缓解；而成年鼠早期出现肺损伤时间则更晚。(4)SARS病毒N蛋白致小鼠肺损伤的早期，幼龄鼠的免疫反应并不活跃，青少年鼠与成年鼠的免疫反应没有明显的不同。

目录

声明

前言

材料和方法

结果

一、外周血白细胞总数变化：

二、肺脏W/D变化：

三、TNF-α含量变化：

四、IFN-γ含量变化：

五、肺组织病理学变化：

讨论

小结

致谢

参考文献

Medical progress：Toll like receptors and inflammatory factors in sepsis and differential expression related to age