微血管改变在压力超负荷引起的小鼠心力衰竭中的作用及机制研究

摘要

多年来,关于血管新生治疗的研究就是全世界范围的热点问题。因为缺血是心脏疾病发病的主要原因之一,因而众多心脏病科学家也很关注促血管新生能否早日应用于心脏疾病的治疗。随着研究的深入,越来越多的研究证实,促血管新生治疗以改善心脏疾病动物模型的心脏功能。许多心脏疾病的终末阶段,大多表现为心力衰竭,而促进心力衰竭进展的一个主要原因就是心肌供氧和需氧之间的失衡,也就是血管数目减少是心力衰竭发病的一个主要原因。虽然现在的药物治疗可以缓解心力衰竭的症状,但是不能完全治愈,若能促进血管新生,来代偿性的缓解心肌缺血缺氧的发病原因,势必会带来更好的治疗效果。目前,促进血管新生的思路大致有三种,一种是通过把促血管新生因子的基因导入体内,使得促血管因子表达,增加血管的生成;一个是通过输入内皮细胞等促进血管或心肌生长的细胞,促进血管新生和心肌再生,来改善心脏的重构和功能:还有一种就是直接注入促血管新生因子的蛋白来促进血管新生,改善心脏的氧供,挽救濒死的心肌。这些策略在动物实验的心脏疾病模型中都取得了明显的效果,如VEGF、FGF和HIF-1的促血管因子的治疗,以及移植心脏干细胞、内皮细胞、骨髓细胞等,都在实验中显示了一定的效果。但是也碰到了一些问题,如细胞的鉴定和存活等。
　　 心力衰竭作为一个常见的疾病和疾病过程,弄清楚心力衰竭发病的分子机制,进一步阐明其发生的原因,会给心脏疾病的进展带来新的方向。结合先前的研究结果,HSF1对心脏有保护作用,但是其具体的机制和作用还没有完全阐明。我们就HSF1对心力衰竭的影响及其机制做了进一步的研究,以求为心脏疾病的治疗提供更清楚的理论基础。
　　 第一部分小鼠心肌内转基因后压力超负荷引起心力衰竭模型的建立
　　 目的:建立成年小鼠心肌内转基因后压力超负荷引起的心力衰竭模型,探讨手术中关键性问题。方法:20只雄性C57BL/6小鼠随机分为LacZ组和PBS组。首先,他们分别在暂时阻断主动脉血流0-30s的同时,左心室心腔内分别注射100μlAd-LacZ和PBS,饲养两天后,给予缩窄升主动脉,缩窄程度大于75％。4周后观察术后小鼠体重、颈动脉血压和心脏超声等变化。HE染色和X-gal染色分别观察心室重构和基因转染情况。实验中,同时有假手术组(Sham)作对照。结果:(1)术后一周,TAC小鼠成活率达95％:(2)同Sham组比较,TAC小鼠血压明显升高(p＜0.01);(3)同Sham组比较,TAC小鼠术后2周心肌明显肥厚,4周时出现心力衰竭(p＜0.01);(4)肉眼和显微镜下观察到,X-gal染色后,LacZ组小鼠阻断主动脉血流10s以上心脏有蓝染,但10s、20s、30s之间无明显区别。结论:(1)该方法建立成年小鼠心肌内转基因心力衰竭模型简单有效,重复性好;(2)左心室心腔直接注射法转染Ad-LacZ基因,同时阻断升主动脉血流10s以上,目的基因即可表达良好。
　　 第二部分过表达p53、VEGF和Angl基因对压力超负荷引起心室重构和心力衰竭的影响
　　 目的:观察过表达p53、VEGF和Ang1基因对压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭过程的影响,寻找其发病机制及治疗方法。方法:将小鼠分成三组:p53组、VEGF+Ang1组和PBS组,用开胸心腔直接注射方法,分别转染腺病毒携带的p53、VEGF+Ang1基因和PBS,转染第2天,缩窄升主动脉,每周做心脏超声检测心脏功能和形态变化,分别于缩窄主动脉后第2天、1周、2周和4周末测量右侧颈动脉压后取材,用HE染色、Masson三色染色、TUNEL和免疫组化观察心脏形态变化和新生血管生成情况,用RT-PCR和Western blot检测p53、VEGF和Angl表达情况。结果:(1)从第2周开始PBS组左室射血分数开始下降,同PBS组比较,p53组下降更明显,且小鼠死亡率升高,VEGF+Ang1组未出现左室射血分数下降,未见到死亡小鼠(组间对比p＜0.05);(2)2-14天,缩窄升主动脉的小鼠心室壁厚度和新生血管数逐渐升高达高峰,14-28天逐渐降低,但同PBS组比较,p53组在每一个时期都显著降低,VEGF+Ang1组与之相反(组间对比p＜0.05);(3)在2-28天,缩窄升主动脉的小鼠心肌细胞凋亡数目逐渐增多,但同PBS组比较,P53组在每一个时期都显著增多,VEGF+Ang1组都显著减少(组间对比p＜0.05);(3)p53、VEGF和Angl蛋白在各自转染组表达升高(组间对比p＜0.05)。结论:P53/VEGF和Ang1分别通过减少/增加新生血管的生成,参与了压力超负荷导致心室重构和心力衰竭发生发展的过程,加剧/延缓了心力衰竭的发生发展。
　　 第三部分热休克转录因子1对压力超负荷引起心室重构和心力衰竭的作用及机制的研究
　　 目的:探讨热休克转录因子1(heat shock transcription factor1,HSF1)对压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭发生发展的影响及其机制。方法:实验动物分成4组:HSF1基因敲除小鼠(Knockout组)、野生型小鼠(Wild-type组)、HSF1转基因小鼠(Transgiene组)和假手术小鼠(Sham组),小鼠经缩窄升主动脉后,每周做心脏超声检测心脏功能和形态变化,分别于第1周、2周和4周末测量右侧颈动脉压后取材,用HE染色、Masson染色和Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色观察心脏形态变化和新生血管生成情况,用Western blotting检测磷酸化Akt和RT-PCR检测缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)mRNA的表达情况。结果:(1)在0d-14d,缩窄升主动脉的小鼠心室壁厚度值和新生血管数逐渐升高达高峰,14d-28d,逐渐降低,但同Wild-type组比较,Knockout组在每一个时期都显著降低,Transgene组都显著升高;(2)Knockout组小鼠左室射血分数第1周就开始下降,Wild-type组小鼠从第2周开始下降,而Transgene组未见到有下降;(3)磷酸化Akt和HIF-1mRNA在Knockout组显著降低,Transgene组显著升高;心脏纤维化和死亡率在Knockout组显著升高,Transgene组显著降低。
　　 结论:HSF1通过调控血管新生,改善了压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭,其中调控HIF-1的表达可能起着重要作用。
　　 第四部分热休克转录因子1对小鼠心肌微血管内皮细胞的作用及机制的研究
　　 目的:探讨热休克转录因子1(heat shock transcription factorl,HSF1)对心肌微血管内皮细胞增殖的影响及其机制。方法:选用HSF1基因敲除小鼠(Knockout组)、野生型小鼠(Wild-type组)、HSF1转基因小鼠(Transgene组)三种成年小鼠,用植块法培养心肌微血管内皮细胞,用Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色鉴定内皮细胞的纯度,用特制硅胶牵张板培养后并用特制牵张器牵张24h,用CCK-8方法检测牵张前后细胞增殖能力的变化,用RT-PCR检测牵张前后缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)和p53mRNA的表达情况,并在Matrigel上培养细胞,观察牵张前后血管形成能力的变化。结果:(1)植块法培养心肌微血管内皮细胞,纯度可达99％以上;(2)牵张后,三组内皮细胞的增殖能力升高、HIF-1和p53mRNA表达增加、形成血管能力增强;(3)牵张前,同Wild-type组比较,Knockout组内皮细胞增殖能力下降、p53mRNA表达增加、HIF-1mRNA表达下降、形成血管数目减少,而Transgene组内皮细胞增殖能力升高、p53mRNA表达下降、HIF-1mRNA表达升高、形成血管数目增多。牵张后,仍有同样的趋势;结论:HSF1可以促进心肌微血管的增殖和形成血管的能力,其中上调HIF-1和下调p53的表达可能起着重要作用。
　　 结论：
　　 1.建立了心肌内转基因后的压力超负荷小鼠心力衰竭模型;
　　 2.P53/VEGF和Ang1分别通过减少/增加新生血管的生成,参与了压力超负荷导致心室重构和心力衰竭发生发展的过程,加剧/延缓了心力衰竭的发生发展。
　　 3.HSF1通过调控血管新生,改善了压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭,其中上调HIF-1和下调p53的表达可能起着重要作用。
　　 4.HSF1可以促进心肌微血管的增殖和形成血管的能力,其中上调HIF-1和下调p53的表达可能起着重要作用。
　　 潜在价值和创新点：
　　 1.建立了心肌内转基因后的压力超负荷小鼠心力衰竭模型;
　　 2.P53/VEGF和Ang1分别通过减少/增加新生血管的生成,参与了压力超负荷导致心室重构和心力衰竭发生发展的过程,加剧/延缓了心力衰竭的发生发展;
　　 3.发现了HSF1通过调控HIF-1和p53的表达,促进心肌微血管的增长和和形成血管的能力,增加了血管新生,改善了压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭的过程。