半乳糖凝集素-3在压力超负荷心力衰竭小鼠心室重构发生发展中的作用

摘要

目的:半乳糖凝集素-3(Galectin-3)作为一种炎性反应介质，在介导心室重构中起着重要作用。心室重构是心力衰竭(Congestive HeartFailure，CHF)发展的基础，是临床结局的重要决定因素，与CHF的进展和不良预后相关。本研究通过改良微创主动脉弓缩窄方法建立压力超负荷CHF小鼠模型，观察随着CHF的发生发展，小鼠心肌组织Galectin-3表达水平的改变，探讨其在压力超负荷CHF小鼠模型心室重构及CHF发生发展中的作用。
　　方法:
　　1.主动脉弓缩窄术CHF模型建立及动物分组:体重18-24克的雄性昆明小鼠，动物称重后，腹腔注射戊巴比妥25mg.kg-1行全身麻醉，左侧第一肋间隙紧邻胸骨左缘切口入胸，剥离主动脉弓，将6-0无损伤丝线套于主动脉弓第一分支（无名动脉）以及第二分支（左颈总动脉）之间，之后将主动脉弓及25 G（直径0.5 mm）注射器针头一并牢固结扎，待结扎牢固后小心抽离针头，即可形成针头直径大小的主动脉弓缩窄。仔细探查止血后，负压关胸。待小鼠苏醒后，装笼饲养，正常饮食;在主动脉弓相同部位套线但不结扎血管，余同上，建立假手术组模型。
　　2.心脏超声检查:于术前及术后8周分别对小鼠行经胸心脏超声检查。小鼠麻醉后，剃除前胸部毛发，于胸骨旁乳头肌水平短轴切面收集主动脉血流情况及左心室二维图像。同时采集二维引导下10个连续心动周期的M型超声心动图纪录。测量左心室收缩期前、后壁厚度(Aws、Pws)、舒张期前、后壁厚度(Awd、Pwd)、左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室舒张末期外径(EXLVDd)、左心室收缩末期内径(LVESd.)和短轴缩短率(FS)。所有测量工作均由有经验的医师在同一彩超仪上完成，每个指标均由两位医师在10个连续心动周期中观测取平均值。其中左心室短轴缩短率(FS％)计算公式:FS％=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]×100。
　　3.血液动力学指标测定:术后8周，小鼠称重、麻醉后，切开小鼠的右颈总动脉，将超微型心导管经切口插入左心室内。连接Nikon4多导生理记录仪，对小鼠的各项血液动力学指标进行测定，包括左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室压力变化最大速率(+dp/dtmax和-dp/dtmax)。测得各项指标后，断颈处死小鼠，取出心脏，冲洗干净并去除大血管、心脏外结缔组织、心房及右心室，称量左心室(LV)重量（包括室间隔）并计算左心室重量/体重比值，即左心室肥厚指数(LVHI)，单位为mg/g。
　　4.组织病理学检测:心室组织标本病理切片HE及MASSON染色，并用显微图像分析系统测量心肌胶原容积百分比(CVF)，心肌胶原容积分数(CVF)=心肌胶原纤维面积/所测视野面积。同时应用兔抗-Galectin-3多抗进行免疫组织化学检测。
　　5.实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测心肌组织Galectin-3 mRNA、胶原纤维Ⅰ mRNA、胶原纤维Ⅲ mRNA的表达:使用异硫氰酸肌-苯酚-氯仿一步法提取心肌组织中的mRNA，按照MMVL一步法RT-PCR试剂盒（沈阳海灵兴业商贸有限公司）提供的说明书加人RT-PCR反应所需的各种试剂:Taq酶、引物、RNA样品、无菌双蒸水至终体积30ul，逆转录条件为38℃，30min;PCR反应条件:95℃15 min，94℃15S，60℃30S，72℃45 S，以上为1个循环。循环45次后，最后72℃再延伸10 min。引物由沈阳海灵兴业商贸有限公司合成，Galectin-3:上游引物:5'-TGG AGC ACT AAT CAG GTGAGC-3'，下游引物:5'-TGA AGC GGG GGT TAA AGT GG-3';胶原纤维Ⅰ:上游引物:5'-TCC CGT CTT TGG GGG TTG-3'，下游引物:5'-CCA AAG AAG ACA TCC CTG AAG-3';胶原纤维Ⅲ:上游引物:5'-CTG GGG CAC CAG GAG AAC-3'，下游引物:5'-CCA AGA AGACAT CCC TGA AG-3';GAPDH:上游引物:5'-TAT CGG ACG CCT GGTTAC-3'，下游引物:5'-CGT TCA AGT TGC CGT GTC-3'。将反应体系置于SLAN荧光定量PCR仪中，采用相对定量的方法，以GAPDH基因mRNA的表达为内参基因，依据公式△Ct=Ct（目的基因）—Ct（内参基因），分别计算出实验组和对照组的△Ct，再依公式△△Ct=△Ct（实验组）一△Ct（对照组）计算出△△Ct值，最后计算2-△△Ct，即相对表达量的差值，2-△△Ct的意义是实验组的目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。
　　6.Western-Blot方法检测心肌组织Galectin-3蛋白:将左心室心肌组织称量后提取心肌蛋白质样品，采用BCA法测定蛋白浓度后，点样于SDS-PAGE凝胶中进行电泳，然后转膜，封闭，抗体杂交，ECL发光并进行凝胶成像分析系统检测。条带对应蛋白质含量=（样品条带的光密度×面积）/(GAPDH的光密度×面积)。
　　7.数据统计分析:所有试验数据采用SPSS18.0软件进行统计处理。连续性资料用均数±标准差（(x)±s）表示，组间比较采用Student'st-test。P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.术后小鼠存活情况及死亡原因:弓缩窄组30只建立CHF模型中，术后24小时存活21只，手术成功率(70％)，死亡9只(30％)。小鼠死亡大多发生在实验开始阶段，因技术不熟练，在主动脉剥离过程中操作失误导致主动脉损伤或破裂出血。3只小鼠于术后3周内因急性CHF死亡，8周存活率85.7％(18/21)。假手术组术后未见死亡。主动脉弓缩窄组小鼠毛发无光泽，均出现不同程度的口唇鼻尖发绀，呼吸急促，食量及活动明显减少，眼睑分泌物增多。
　　2.小鼠左心室形态各参数变化:与假手术组比较，弓缩窄组EXLVDD、Aws、Awd、Pws、Pwd明显增加(p＜0.05); LVEDD、LVFS显著降低(p＜0.05)。
　　3.小鼠血流动力学各参数变化:术后8周，弓缩窄组LVEDP较假手术组增加(6.4±1.8 vs4.6±0.8，P＜0.05)，而LVSP和±dp/dtmax明显下降(LVSP:93.4±4.5 vs111.4±2.5;+dp/dtmax:5214.5±464.9 vs7400.5±208.2;-dp/dtmax:5120.8±240.6 vs6468.5±209.6，P＜0.05)，说明模型制备成功。
　　4.组织病理学检测:弓缩窄组小鼠体重下降，LV质量增加，且VLHI较假手术组明显增加(5.2±0.3 vs3.1±0.2，P＜0.05)。光镜下可见弓缩窄组肌纤维排列紊乱，部分区域肌纤维溶解，心肌细胞水肿、肥大、局灶坏死，细胞数目减少，细胞核大小不均一，小血管壁增厚，大量蓝绿色胶原纤维包绕分割心肌细胞，间质增生伴炎性细胞浸润。与假手术组相比较，弓缩窄组MASSON染色心室CVF明显增加（12.02±0.71 vs2.56±0.42，P＜0.05）。免疫组织化学检测，弓缩窄组小鼠心肌Galectin-3的表达明显增强，且在心肌纤维化区域更为显著。
　　5.实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测心肌组织Galectin-3 mRNA、胶原纤维Ⅰ mRNA、胶原纤维Ⅲ mRNA的表达:采用相对定量的方法，以GAPDH基因mRNA的表达为内参基因，结果以弓缩窄组目的基因的表达相对于假手术组的变化倍数表示。两组Galectin-3 mRNA相对表达水平，与假手术组比较，弓缩窄组高，其相对表达量相比具有显著统计学差异（1.67±0.08 vs0.83±0.06，P＜0.05）;两组胶原纤维Ⅰ mRNA相对表达水平，与假手术组比较，弓缩窄组高，其相对表达量相比具有显著统计学差异(1.35±0.03 vs0.38±0.02，P＜0.05);两组胶原纤维Ⅲ mRNA相对表达水平，与假手术组比较，弓缩窄组高，其相对表达量相比具有显著统计学差异(0.46±0.07 vs0.24±0.04，P＜0.05);两组Ⅰ/Ⅲ胶原相对表达水平比值相比，弓缩窄组显著高于假手术组(2.88±0.76 vs1.62±0.56，P＜0.05)。
　　6.心肌组织Galectin-3蛋白的Western-Blot检测:采用Western-Blot方法检测心肌组织Galectin-3蛋白质含量:相对于假手术组，弓缩窄组心肌组织Galectin-3蛋白表达明显增高(1.48±0.07 vs0.74±0.05 P＜0.05)。
　　结论:
　　1.改良微创主动脉弓缩窄方法可以成功建立和临床上压力超负荷状态所诱发的CHF病理生理过程相似的CHF动物模型，该模型对研究CHF机理具有重要意义。
　　2.心室重构在压力超负荷状态所诱发CHF的发生发展中起到了重要作用，其不仅表现为心室功能状态的重构（收缩、舒张），也有心室结构的重构（左心室的大小、形态、组织结构）。
　　3.Galectin-3在压力超负荷状态所诱发CHF心肌组织表达明显增强，且在心肌纤维化区域更为显著，提示Galectin-3在压力超负荷状态所诱发CHF的心室重构发生发展中具有重要作用。