RNAi抑制Wnt1信号通路对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y增殖抑制的实验研究

摘要

研究背景与目的:神经母细胞瘤是小儿最常见的恶性实体肿瘤,来源于胚胎神经嵴的交感神经元,研究发现胚胎发育的异常与神经母细胞瘤的发生密切相关。Wnt信号通路是调控胚胎发育的关键途径之一,Wnt分泌性糖蛋白家族是调控细胞分化、细胞增殖、细胞极性及细胞迁移的一组分子信号。在经典的Wnt信号传导通路中,Wnt蛋白与细胞膜上受体Frizzled(卷曲蛋白,Fz)结合,通过一系列的胞内分子的相互作用,最终导致β-连环蛋白(β-catenin)在胞质内积聚,进入核内与转录因子TCF/LEF(淋巴增强因子/T细胞因子)等家族成员相结合,调控基因表达,从而调控细胞的生长、发育、分化和肿瘤的发生。近年来的研究发现在神经嵴的诱导发生及分化过程中,有Wnt蛋白及其所属信号通路的参与。其中Wnt1的过表达将导致小鼠神经嵴细胞增多；抑制Wnt1的表达将会导致神经嵴衍生物明显不足,神经前体细胞显著减少；Wnt1可以调控由神经生长因子(NGF)所诱导的神经嵴细胞分化。因此,本实验的研究目的是检测人神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y中Wnt1的表达,并通过抑制Wnt1基因的表达来干预Wnt1信号通路,观察其对神经母细胞瘤的增殖的影响,说明wnt1信号通路与神经母细胞瘤之间的相关性。
　　 材料和方法:
　　 主要材料:人神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y(购自中国协和医科大学细胞中心),siRNA(上海吉玛制药技术有限公司合成),Wnt1抗体(北京奥维亚公司)及β-catenin抗体(Sant Cruz公司)等。
　　 实验分组:将SH—SY5Y细胞分为四组,分别为阴性对照组、空白载体组、非特异性siRNA组和Wnt1-siRNA组。
　　 方法:分别使用PCR、Western-blot和免疫荧光三种方法检测人神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y中Wnt1在基因和蛋白水平的表达及细胞内定位情况。并用针对Wnt1的特异性siRNA干预该细胞中Wnt1信号通路的传递,用Western-blot方法检测Wnt信号通路中相关蛋白包括Wnt1及β—catenin浓度的变化；显微镜下观察细胞形态、数量的改变；用MTT方法检测肿瘤细胞增殖情况。采用方差分析(ANOVA)的方法比较干预前、后Wnt1通路中相关蛋白及细胞增殖的变化。
　　 结果:PCR和Western-blot方法检测显示人神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y中的Wnt1在mRNA转录水平以及蛋白水平均有较好的表达,且免疫荧光显示其位于细胞浆内。采用Wnt1的特异性siRNA技术干预人神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y后,Wnt1特异性siRNA干预组中Wnt1蛋白的表达较阴性对照组、空白载体组及非特异性siRNA组明显下降,其下游通路中的关键蛋白β—catenin的表达同样明显下降；光学显微镜下发现特异性干预组中细胞明显较其它三组少,死亡漂浮的细胞较多,细胞突触减少；MTT结果提示,Wnt1基因表达被抑制后,SH—SY5Y细胞的增殖率明显下降。
　　 结论:
　　 1.Wnt1在人神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y中呈阳性表达。
　　 2.阻断Wnt1信号通路可以抑制人神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y的增殖,因此,Wnt1信号通路可能是影响神经母细胞瘤增殖的重要通路。
　　 3.应用RNA干扰技术抑制Wnt1基因表达的体外实验可以为神经母细胞瘤的治疗提供新的切入点。