融合基因ag85B-mpt64190-198-mtb8.4在抗结核新型重卡介苗及亚单位疫苗研究中的应用

摘要

结核病(Tuberculosis,TB)是一种古老而漫长的感染性疾病,是长期危害人类健康的严重疾病之一。近年来,由于HIV和结核分枝杆菌双重感染,以及耐药型结核分枝杆菌的流行,导致结核病的发病率和死亡率大幅度上升。目前全球大约有20亿人感染上结核病,感染人数接近全世界人口的三分之一,其中每年有85％的死于结核病的患者,以及95％的疑似新发结核病例,都发生在发展中国家。结核病严重威胁着人类健康,联合国已将结核病列为21世纪重点控制的三大疾病之一。
　　 目前研制成功的唯一的能够预防结核病的疫苗——卡介苗,虽然已在全球范围内广泛使用,但在近期研究中发现,其许多临床试验结果并不是十分有效,免疫预防效果不稳定,在全球范围的免疫保护力检测,由0-80％不等,并且对成人几乎无效,对已感染患者更是没有治疗作用,可以说卡介苗并不是预防肺结核的理想疫苗,研究和开发新的结核疫苗势在必行!
　　 现阶段研究结核病疫苗主要集中在以下几个领域:
　　 1.以BCG为载体,重组进新基因的重组BCG,使其比亲代卡介苗具有更强的抗原性和免疫性,以代替现在使用的卡介苗.
　　 2.结核蛋白疫苗,用于BCG免疫后的加强免疫。
　　 3.营养缺陷型结核减毒活疫苗
　　 4.结核DNA疫苗
　　 本研究就是针对结核疫苗研究的两个方面,重组BCG研究和亚单位疫苗的研究来开展工作的。
　　 一.重组BCG疫苗的研究
　　 由于BCG预防免疫效果不稳定,我们需要研究免疫效应强于BCG的疫苗才能有效提高对结核病的防护作用。对BCG加以改良的方式也有多种:将BCG缺失的重要的保护性抗原重组入BCG,或是在BCG中过量表达主要的保护性抗原,促进抗原的释放和呈递,增强机体免疫反应。而由于重组多价抗原疫苗,往往能够比单一抗原疫苗激发更强的免疫反应,因此在近些年研究中,也越来越受到重视。
　　 本研究工作主要是选择结核分枝杆菌最重要的保护性抗原Ag85B,ESAT6,以及Mtb8.4,与具CD8+T细胞表位的一段Mpt64抗原的肽段和结核杆菌休眠期表达的抗原HSPX,以不同的组合方式,构建了三株重组BCG疫苗,其中以大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV261为载体的有rBCG-Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4和rBCG-Ag85B-ESAT6-Rv2031c(HSPX),另一个是以大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361为载体构建的rBCG-Ag85B-ESAT6。均为国内外首次报道。
　　 将上述三株重组BCG和BCG分别免疫小鼠,通过分析IFN-γ的分泌,IgG水平、以及IgG2a/IgG1,比较了它们的免疫原性。研究结果表明,三株重组BCG针对特异抗原均可以引起特异性的较BCG强的细胞免疫反应。其中P261-rBCG-Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4的免疫原性较高,而且还能诱导比其它重组BCG更强的Th1型免疫反应,这正是成功抗击结核病的关键因素。
　　 因此我们选择P261-rBCG-Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4(P261-rBCG-AMM)作为候选疫苗,进一步做了以下研究工作:在免疫原性水平上,P261-rBCG-AMM不仅能够诱导产生特异性较BCG强的IFN-γ水平,并且还能激起体内特异的CD4+和CD8+活性T细胞,能够诱导人单核细胞产生与BCG水平相类似的TNF-α,能够长期有效的诱导比BCG高的Th1型免疫反应;在毒力攻击保护实验中,研究结果显示,攻毒后6周P261-rBCG-AMM免疫的小鼠肺部菌落数较少,净体重增加。肺部组织的病理改变要轻于BCG免疫组,抗酸染色结果显示,随着免疫时间的延长,重组BCG免疫的小鼠肺部组织的结核杆菌数最少。因此P261-rBCG-AMM能够产生与BCG相当甚至更好的保护作用。另外,我们通过比较重组BCG和BCG的生长曲线,以及免疫小鼠后,脏器内菌落数的变化,发现重组BCG并没有因为加入新的重组基因而导致生长状态发生改变,其生长曲线仍和BCG的类似,而且脏器内菌落数随着时间变化的趋势也与BCG大体吻合。这就证明重组BCG能够激起较强的免疫保护反应,并不是因为重组BCG在动物体内数量的增加,而是因为重组BCG表达有重组基因的结果。关于P261-rBCG-AMM的免疫原性和免疫保护性评价也属首次报道。
　　 二.融合基因在蛋白疫苗研究中的应用
　　 将Ag85B、MPT64190-198和Mtb8.4三种重要的保护性抗原物质融合表达,构建了融合多肽Ag85B-Mpt64(190-198)-Mtb8.4(AMM)。表达纯化AMM蛋白,将其和Ag85B蛋白分别与IFA混合免疫小鼠。研究表明它可以激活比单个Ag85B蛋白更有效的细胞免疫反应,以及更强的Th1型免疫反应。AMM的两个组分Ag85B和MPT64190-198均可刺激免疫小鼠的脾淋巴细胞表达分泌IFN-γ。
　　 另外将AMM蛋白与不同佐剂(包括FIA,MPL,壳聚糖微球体)混合,免疫小鼠后,观察免疫指标,结果发现,FIA的辅助免疫功能最强,壳聚糖微球体虽然辅助功能稍逊于FIA,但是由于其使用安全,经过必要的改造,有可能发展为一个良好的佐剂。重组蛋白疫苗AMM被证实也是一种潜在的新型抗结核疫苗。可以进行免疫保护性等相关评价。