谷氨酰胺缺乏对新生大鼠胃肠道功能影响的研究

摘要

目的:谷氨酰胺是营养和代谢领域最为关注的研究课题之一,但是,目前在静脉营养液中不补充谷氨酰胺(Gln),正在研究中的Gln添加剂也不稳定。本文进行Gln相关研究以期待对危重病进行更好的营养支持。而由于技术方面的原因,进行了种种比较后,我们准备利用MS(methioninesulfoximine),人为造成新生幼鼠体内Gln缺乏来模拟新生儿出生后低Gln的状态来进行肠道改变的研究,在母鼠喂养条件下造成新生大鼠谷氨酰胺缺乏后,观察新生鼠肠道改变。
　　 方法:购买清洁级SD孕鼠10只,放置在复旦大学医学院实验动物中心饲养。孕鼠分娩后形成10窝新生幼鼠,每2窝为一组,并按照试验要求分组研究,新生小鼠出生后进行标记,每天进行称重。MS粉剂(methioninesulfoximine)用无菌注射用水配成25g/L母液,保存在4℃冷藏室。注射MS量100mg/kgd。分组情况:第1组母鼠分娩后第3天起不用MS×6天+新生幼鼠生后第3天起不用MS×6天;第2组母鼠分娩后第3天起腹腔注射MS×6天+新生幼鼠生后不用MS×6天;第3组母鼠分娩后第1天起腹腔注射MS×6天+新生幼鼠生后不用MS×6天;第4组母鼠分娩后第3天起腹腔注射MS×6天+新生幼鼠生后第3天起腹腔注射MS×6天;第5组母鼠分娩后不用MS×6天+新生幼鼠生后3天起腹腔注射MS×6天;
　　 实验进行到第7天,在称量后处死新生幼鼠取血,离心取上清液,使用高效液相色谱法对血浆谷氨酰胺浓度测定。纵向剖开回肠末端肠道组织,刮取粘膜称重(约50mg-100mg),在冰壶上匀浆,每50mg的粘膜组织加入PBS液1ml混匀,17,500g×15min,4℃离心,取上清,-70℃保存待测。根据ELISA试剂盒操作说明书进行各组肠道粘膜的细胞因子表达水平测定IL-1、TNF-α、MCP-1。肠道黏膜组织切片,经HE染色在光镜下观察绒毛的长度和宽度的变化。
　　 结果经过对5组新生幼鼠的不同处理方式,造成了5组之间血浆Gln浓度的显著差异,通过比较还可以发现这种Gln浓度的差异与肠道形态学的变化,与炎症有关的细胞因子的变化是存在一定联系的。第1组作为正常对照组与其余4组相比,出现明显Gln浓度最高,肠道绒毛高度最长,肠道绒毛的排列最为整齐不杂乱,肠道黏膜组织匀浆液细胞因子检测中MCP-1,IL-1β水平相对较高。相反,第4组由于母鼠和新生幼鼠同时进行MS腹腔注射,相对于新生幼鼠而言内源性和外源性来源的Gln同时受到抑制,结果血浆Gln浓度最低,仅为正常对照组的1/9水平,形态学也发生明显改变,肠道绒毛最短,排列最紊乱,甚至有脱落,因此肠道的完整性也最差,从肠道黏膜组织匀浆液细胞因子的检测中可以看到MCP-1和IL-1β水平最低,也就暗示着在遭遇感染等炎症刺激时,由于这些细胞因子存在紊乱,因而在炎症刺激时容易出现免疫紊乱而造成抵抗病原微生物能力降低。另外3组介于1和4组之间,不同程度的表现出血浆Gln浓度降低,肠道绒毛高度变短、排列不齐,组织匀浆液细胞因子MCP-1和IL-1β的水平降低,所以,抵抗感染的能力也将不同程度的降低。虽然第4组的死亡率相对于其余4组较高,但是第4组动物在Gln浓度、肠道绒毛高度、细胞因子MCP-1上变化最为明显。
　　 结论:因此通过本实验,可以选择变化最为明显的第4组,即母鼠分娩后第3天新生幼鼠生后第3天起均腹腔注射MS6天,在母鼠喂养条件下建立起Gln缺乏的新生动物模型。通过本实验建立起的缺乏谷氨酰胺的新生动物模型,从而对进步进行Gln对肠道作用机理,以及在内毒素血症情况下Gln保护作用的研究打下基础。