灵芝与罗布麻提取物对神经元缺氧复氧损伤的保护作用及其机制的离体研究

摘要

脑缺血后的病理生理过程复杂,脑缺血再灌注损伤级联反应其中一环是细胞凋亡,抑制神经细胞凋亡有利于缺血性脑血管病的治疗。中药活性成分的多样性常常与损伤级联的复杂性具有针对效应。灵芝和罗布麻是我国传统中药的珍品,国内外的研究表明:灵芝多糖、灵芝甾醇及罗布麻总黄酮可能通过抑制氧化应激对脑缺血有保护作用。氧化应激反应是导致凋亡的最重要途径之一。因此,本文研究灵芝及罗布麻提取物抗凋亡作用及其可能机制。
　　 第一部分:灵芝提取物(Ganodermalucidiumextract,GLE)对神经元缺氧复氧损伤的保护作用及其机制研究
　　 目的研究GLE对原代大鼠皮层神经元OGD损伤模型的影响,在细胞水平探讨GLE神经保护作用的科学机制。
　　 方法新生SD大鼠的皮层神经元原代培养至第7天,GLE预处理神经元OGD模型。选取OGD复氧后的0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h作为观察点,观察GLE干预后对各个时间点的细胞形态学、细胞毒作用、细胞线粒体活性、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的表达量(caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和Bax)的影响。细胞形态学采用倒置相差显微镜观察;细胞毒作用采用LDH释放测定:细胞线粒体活性采用XTT检测分析;细胞凋亡率采用流式细胞技术检测:蛋白质表达水平分析采用westernblot。
　　 结果一.光镜形态学观察:OGD复氧后3h开始,神经元损伤进行性加重,OGD复氧后72h时损伤最明显,GLE能减轻缺氧复氧对神经元的损伤。二.LDH的释放量在OGD复氧后3h开始有所增高,随复氧时间的延长进一步增高,复氧后72h达到最高值。各浓度GLE组在OGD复氧后3h、6h、12h、24h、48h和72h均能明显减少LDH的释放,有明显统计学差异(P＜0.05),并随着浓度的增加及用药时间的增加而作用增强。三.OGD复氧后3h细胞线粒体活性开始逐渐降低,随复氧时间的延长进一步下降,复氧后72h达到最低值,各浓度GLE组能增强细胞活力,并随着浓度的增加及用药时间的增加而作用增强。四.OGD复氧后24h时,模型组平均凋亡率较正常组显著增高(P＜0.001),各浓度GLE组平均凋亡率较模型组显著降低(P＜0.001)。OGD复氧后72h时,各浓度GLE组平均凋亡率明显低于模型组(P＜0.001),浓度越高作用越强。五.OGD复氧后24h时,westernblot结果显示模型组caspase-3,caspase-8caspase-9蛋白表达增高;各浓度的GLE均能抑制caspase-3,caspase-8的表达;10μg/ml的GLE能抑制caspase-9蛋白的表达,但0.1μg/ml、1μg/m1GLE均未能抑制caspase-9的表达。另外,模型组Bcl-2蛋白明显下降,Bax蛋白表达明显增高,GLE各浓度组的Bcl-2蛋白的表达下降不明显;各浓度的GLE组均能明显抑制Bax蛋白的表达。
　　 结论一.GLE对OGD皮层神经元损伤有显著的神经保护作用;二.GLE可能通过抑制caspase-3激活,上调bcl-2/Bax的比值而减少缺氧复氧神经元凋亡;三.GLE可能通过下调caspase-8和caspase-9进而抑制caspase-3表达。
　　 第二部分:罗布麻提取物(Apocynumvenetumleafextract,AVLE)对神经元缺氧复氧损伤的保护作用及其机制研究
　　 目的研究GLE对原代大鼠皮层神经元OGD损伤模型的影响,在细胞水平探讨GLE神经保护作用的科学机制。
　　 方法新生SD大鼠的皮层神经元原代培养至第7天,AVLE预处理神经元OGD模型。选取OGD复氧后的0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h作为观察点,观察GLE干预后对各个时间点的细胞形态学、细胞毒作用、细胞线粒体活性、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的表达量(caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和Bax)的影响。细胞形态学采用倒置相差显微镜观察;细胞毒作用采用LDH释放测定:细胞线粒体活性采用XTT检测分析;细胞凋亡率采用流式细胞技术检测;蛋白质表达水平分析采用westernblot。
　　 结果一.光镜形态学观察:OGD复氧后3h开始,神经元出现损伤进行性加重,OGD复氧后72h时损伤最明显,500μg/ml和5000μg/mlAVLE干预组在OGD复氧后24h至72h有减轻神经元损伤的作用。二.LDH的释放量在OGD复氧后3h开始有所增高,随复氧的时间延长进一步增高,至72h达到最高值。5000μg/mlAVLE组在OGD复氧后12h、24h、48h和72h时均能明显减少LDH的释放,500μg/mlAVLE在OGD复氧后48h、72h能明显减少LDH的释放,有明显统计学差异(P＜0.05)。三.OGD复氧后3h开始细胞线粒体活性逐渐降低,随复氧时间的延长进一步下降,至72h达到最低值,5000μg/mlAVLE组在OGD复氧后12h、24h、48h和72h时能增强细胞活力,而500μg/ml在OGD复氧后48h、72h才体现出增强细胞活力的作用。四.OGD复氧后24h时,模型组平均凋亡率较正常组显著增高(P＜0.001),5000μg/mlAVLE组平均凋亡率较模型组显著降低(P＜0.001),但50μg/m1和500μg/mlAVLE与模型组相比无明显差异;OGD复氧后72h时,500μg/mlAVLE组和5000μg/mlAVLE组的平均凋亡率均较模型组显著降低(P＜0.05),50μg/mlAVLE与模型组相比无明显差异。五.OGD复氧后24h时,westernblot结果显示模型组caspase-3,caspase-8caspase-9蛋白表达增高;5000μg/mlAVLE能抑制caspase-3,caspase-8的表达,50μg/ml和500μg/mlAVLE抑制效果不明显;各浓度的AVLE均未能抑制caspase-9的表达。另外,模型组Bcl-2蛋白明显下降,Bax蛋白表达明显增高,AVLE各浓度组的bcl-2蛋白表达均明显下降;5000μg/mlAVLE能明显抑制Bax蛋白的表达,但50μg/ml和500μg/mlAVLE对Bax的抑制效果不明显。
　　 结论一.AVLE对OGD皮层神经元损伤有一定的神经保护作用:二.AVLE可能通过抑制caspase-3的激活,上调bcl-2/Bax的比值而减少缺氧复氧神经元凋亡;三.AVLE可能通过下调caspase-8进而抑制caspase-3表达。