CpG基序甲基化状态及其调控因素在SLE发病机制中的作用研究

摘要

第一部分SLE患者与正常人CpG基序甲基化状态与DNMT的表达
　　目的：研究系统性红斑狼疮患者(SLE)CpG基序甲基化状态和DNA甲基转移酶(DNMT)的mRNA表达水平,并探讨两者的关系。
　　方法：分离38例SLE患者与19例正常人外周血淋巴细胞,分别用5-甲基胞嘧啶抗体与流式细胞仪检测CpG基序甲基化水平和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的mRNA表达水平。
　　结果：活动期SLE患者的CpG基序甲基化水平(8.08±1.70)低于正常对照组(11.61±1.20,P<0.01)与缓解期SLE患者(10.97±1.46,P<0.05),正常人与缓解期SLE患者的CpG基序甲基化水平相比,差异无统计学意义(P>0.05)。SLE患者的CpG基序甲基化水平与SLE-DAI成负相关(r=-0.79,P<0.05)。活动期SLE患者(0.4214±0.178)与缓解期SLE患者(0.5164±0.162)的DNMT1表达水平均低于正常对照组(0.7814±0.192,P<0.05)。活动期、缓解期SLE患者DNMT1的表达水平相比,无明显统计学意义(P>0.05)。活动期(0.6984±0.183)、缓解期(0.760±0.175)SLE患者及正常人(0.724±0.158)的DNMT3A表达水平相比,差异无统计学意义(P>0.05)。DNMT3B的表达水平极低。活动期与缓解期SLE患者DNMT1的表达水平与SLE-DAI的相关性不明显(r=-0.23,P>0.05)。SLE患者CpG基序甲基化水平与DNMT1的表达水平相关性不明显(r=0.28,P>0.05)。
　　结论：SLE患者CpG基序甲基化水平的下降在SLE发病机制中具有重要作用。DNMT1表达水平的下降在SLE发病机制中可能起重要作用,但不是决定SLE患者CpG基序甲基化状态的惟一因素。
　　第二部分内外因素对CpG基序甲基化状态与DNMT1表达的影响
　　目的：探讨5-氮杂胞苷、雌二醇及紫外线(254nm)对SLE患者与正常人CpG基序甲基化状态与DNMT1表达的影响。
　　方法：分离12例SLE患者与11例正常人外周血淋巴细胞,经PHA刺激1天后,分为未处理组、5-氮杂胞苷组、雌二醇组、紫外线组,继续培养3天后分别用5-甲基胞嘧啶抗体与流式细胞仪检测CpG基序甲基化水平和实时定量逆转录-聚合酶链反应(realtimeRT-PCR)分析DNMT1的mRNA表达水平。
　　结果：与非处理组相比,5-氮杂胞苷组SLE患者与正常人的CpG基序甲基化水平均下降(p<0.1),DNMT1表达水平的下降无统计学意义(p>0.05);雌二醇组、紫外线组SLE患者与正常人的CpG基序甲基化水平与DNMT1的mRNA表达水平的差异均无统计学意义(p>0.05)。 结论：5-氮杂胞苷可抑制CpG基序甲基化状态,其抑制作用的产生与DNMT1表达水平的下降无明显相关性。雌二醇与紫外线(254nm)对CpG基序甲基化状态与DNMT1的表达水平的影响无统计学意义。
　　第三部分甲基CpG结合域蛋白的构建、表达、鉴定
　　目的：在大肠杆菌中表达甲基CpG结合域四聚体蛋白,并对其进行纯化和鉴定。
　　方法：将重组表达质粒4×MBD-pETI30b+转化大肠杆菌DH5a克隆扩增并测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)后接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,表达产物经Ni-NTA亲和纯化,通过SDS-PAGE和Westemblotting鉴定蛋白表达。
　　结果：克隆质粒测序结果与理论预期完全一致,SDS-PAGE显示在大肠杆菌中表达出分子量为46000的目标蛋白,Westernblotting显示目标蛋白带有His融合标签(氨基端)和HA标签(羧基端)。
　　结论：成功表达、纯化了甲基CpG结合域四聚体蛋白,为今后进一步研究DNA甲基化及其调控因素奠定了基础。

目录

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 SLE患者与正常人CpG基序甲基化状态与DNMT的表达

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

附图

第二部分 内外因素对CpG基序甲基化状态与DNMT1表达的影响

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

附图

第三部分 甲基CpG结合域蛋白的构建、表达、鉴定

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

附图

全文参考文献

综述

附录

致谢