β-TCP多孔生物陶瓷软骨组织工程支架的研发及应用研究

摘要

【目的】:β-TCP是一种较理想的骨组织工程无机支架材料,传统的β-TCP生物陶瓷制作方法制作的生物陶瓷,其微结构难以控制,应用于软骨组织工程的较少。近年来法国地中海大学成功地研制了微孔结构可控的β-磷酸三钙多孔陶瓷材料,该材料不仅具有良好的生物相容性和较高的机械强度,而且可调控微结构以适合软骨组织工程构建的需要。我们和上海贝奥路公司合作,通过研究不同微结构的生物陶瓷支架复合软骨细胞体外培养的结果,发现适合软骨组织工程构建的生物陶瓷支架材料微结构。通过对兔解剖结构的测量,建立兔关节软骨缺损模型,进行体内生物陶瓷支架软骨修复动物实验,观察并评估软骨修复效果,从而找到适合体内软骨组织构建的生物陶瓷支架。为β-TCP材料进一步临床应用于关节软骨缺损的修复提供实验依据。
　　【方法】:(一)选取二月龄健康新西兰大白兔,耳缘静脉注射空气栓塞处死,取双侧股骨髁、肱骨及胫骨,剔除周围软组织,分别使用游标卡尺及64排CT重建进行测量,获取各项解剖数据。(二)消化分离成年兔肋软骨细胞及关节软骨细胞进行体外培养,观察两种软骨细胞的细胞获得率、存活率、细胞贴壁率、形态学变化、MTT法测定细胞增殖速度,并且进行甲苯胺兰染色、亮绿-番红花“0”染色、二甲基亚甲基蓝法测定硫酸糖胺多糖。从而优选出适合软骨组织工程研究的合适的软骨细胞及其传代数。(三)通过对肋软骨细胞复合不同微结构的生物陶瓷材料进行体外培养,计算软骨细胞在支架内增殖生长的不同趋势,优选出适合软骨细胞生长的β-TCP生物陶瓷支架的合适微结构。(四)利用专利技术,在前期研究的基础上,烧结出适合软骨组织工程构建的具有合适微结构的β-TCP生物陶瓷支架材料。(五)将体外实验优选的适合软骨细胞生长的微结构的β-TCP生物陶瓷支架材料复合肋软骨细胞植入兔关节软骨缺损模型中,以验证该微结构修复动物体内关节软骨缺损的可行性。
　　【结果】:(一)解剖测量的结果得到了兔股骨髁、肱骨及胫骨的各项数据,并且进行了CT三维重建,测量结果显示肱骨头软骨面至骺线距离4.5±0.2mm。胫骨内侧平台宽度为6.1±0.4mm,外侧平台宽度为6.4±0.3mm,但胫骨平台表面覆盖有半月板组织,无法进行手术显露,这两个部位都无法满足体内试验的需要。股骨内侧髁宽度为5.0±0.2mm,外侧髁宽度为4.0±0.1mm,两侧髁的宽度都较小,并且表面形态较不规整,同样不满足体内试验的需要。股骨滑车宽度为6.5±0.5mm,滑车近髁间窝表面软骨至髓腔距离为9.1±0.6mm,并且表面形态较规整,可以适合体内试验的需要。(二)利用专利技术进行适合软骨组织工程研究的合适微结构β-TCP生物陶瓷支架材料的烧制,并且进行相关理化性能的表征检测。(三)两种软骨细胞体外培养的结果显示关节软骨:消化时间为6.49±1.87h,细胞获得率为5.79±1.7×10 5/100mg。肋软骨:消化时间为4.14±1.45h,细胞获得率为4.76±1.2×10 5/100mg,肋软骨细胞和关节软骨细胞在细胞获得率、存活率、贴壁率上都不具有统计学意义,而肋软骨细胞的消化时间却低于关节软骨细胞,P值为0.0032。二甲基亚甲基蓝法测定细胞传代培养液中GAG的含量,显示1代软骨细胞及2代软骨细胞分泌GAG的量和原代细胞相似无统计学差异,但从第3代软骨细胞开始则开始具有统计学差异。(四)对软骨细胞复合不同微结构的支架材料培养的结果显示,培养第一周,不同内连接径及孔径的支架材料中种植的肋软骨细胞的生长速度无明显差异,但是从第二周开始,在孔径相同的条件下内连接径120μm的支架材料生长速度明显快于其他内连接径的支架材料,这种情况一直延续到第四周。(五)进行体内动物实验认证,结果证明肋软骨细胞复合β-TCP生物陶瓷材料可以修复兔关节软骨缺损,4月后的2代肋软骨细胞组组织学评分为20.76±2.13,甲苯氨兰、番红及Ⅱ型胶原染色均显示软骨组织修复较为完全。
　　【结论】:兔股骨滑车近髁间窝软骨缺损的动物模型是有效的,适合软骨细胞组织工程研究。软骨种子细胞优选的结果发现肋软骨细胞在体外生长速度较快,分泌糖胺聚糖的量更多,从体外扩增数量的角度出发,2代软骨细胞较适合软骨组织工程构建的需要。微结构不同的生物陶瓷支架材料对肋软骨细胞体外培养的结果是有差异的,孔径为500-630μm,内连接径120m的生物陶瓷材料体外培养较适合软骨细胞体外生长的需要。体内动物实验的结果发现,不同的复合方式软骨修复结果是有差异的。肋软骨细胞经体外培养至2代后复合生物陶瓷支架材料修复动物关节软骨缺损的结果较原代消化细胞直接复合支架材料修复动物关节软骨缺损效果为好。硬质生物陶瓷材料完全可以作为软骨工程的支架材料。硬质支架材料上层软骨细胞成软骨,下层软骨细胞则未成软骨组织,趋向转化成骨。

目录

中文摘要

英文摘要

前言

第一章节 β-TCP多孔生物陶瓷软骨组织工程支架的研制及理化性能表征

第二章节 动物相关解剖数据测量及软骨缺损模型设计

第一部分 兔相关解剖数据大体测量

第二部分 CT测量兔相关解剖数据

参考文献

第三章节 软骨组织工程细胞种子的优选

第一部分 兔膝关节及肋软骨细胞的分离和培养

第二部分 兔膝关节及肋软骨细胞的组织学检测

参考文献

第四章节 β-TCP多孔生物陶瓷软骨组织工程支架微结构的优选

第五章节 动物实验的认证

全文总结

综述一 软骨组织工程支架材料进展

综述二 软骨组织工程种子细胞及培养方法的进展

致谢

文章撰写与发表