miR-143/miR-145在结直肠癌发病中的调节作用

摘要

背景:microRNA(miRNA)是一类非编码小RNA分子,由18-25个核苷酸组成,通常在转录后水平调控基因表达,是近几年来的研究热点。miRNA基因先转录产生几百至几千个核苷酸的原始miRNA(pri-miRNA),在核内被RNaseⅢ内切酶家族的Drosha酶切割成70个核苷酸左右的发夹状前体miRNA(pre-miRNA),pre-miRNA在转运蛋白Exportin-5的作用下转运出核,然后经Dicer酶切割形成约22个核苷酸组成的双链miRNA。双链miRNA通过与TRBP等结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),之后双链miRNA中一条被分离并迅速降解,成熟miRNA与靶标基因mRNA的3’端非编译区(3’UTR)互补配对的位点不同程度匹配结合,诱导靶标基因mRNA降解或阻遏其转录后翻译,调节细胞增殖、分化与凋亡,参与个体发育、机体代谢等过程。肿瘤是一种复杂的基因相关疾病,涉及到编码和非编码基因的结构和表达异常。随着B细胞慢性淋巴瘤中miRNA表达水平改变的发现,人类多种肿瘤中均发现miRNA的表达变化,包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌等。miRNA在肿瘤中的发生、发展中起着癌基因或抑癌基因的作用。目前认为引起miRNA在肿瘤细胞中表达水平发生改变的可能原因包括染色体重组、基因扩增、突变及表观遗传学改变等。结直肠癌是第三位最常见的肿瘤,也是引起肿瘤相关死亡的重要原因之一。miRNA在结直肠癌的发生、发展中起着非常重要作用,研究发现多种miRNA分子在结直肠癌中表达异常。其中miR-143、miR-145、miR-34a和let-7等在癌细胞中表达较正常粘膜上皮细胞中明显降低,它们分别通过作用于ERK5、RAS、c-myc和E2F的mRNA调节结肠癌的发生和发展。寻找与结肠癌相关的miRNA分子,闸明其作用机制,将可能丰富结石肠癌的病因学和分子病理学理论。结直肠癌相关miRNA的研究可作为结直肠癌早期诊断、化疗疗效评估、新型抗癌药物的开发提供重要理论支持。本研究课题在目前研究的基础上,深入研究结直肠癌发生、发展密切相关的miRNA,包括miR-143/miR-145,检测其在结直肠癌发生、发展中的作用,并运用生物信息学手段预测其与结直肠癌发病相关靶标基因ErbB3,N-ras和K-ras等,通过各种分子生物学和细胞生物学检测手段验证这两个miRNA与其靶标的对应调节关系,并研究它们参与结直肠癌发病的调节作用及其机制,从而为深入探讨结直肠癌的发病机制及进一步的治疗方案的设计提供理论基础。
　　目的:寻找并验证与结直肠癌发病密切相关的miRNA。阐明这些与结肠癌发病密切相关的miRNA对结直肠癌发病的调节作用。并通过生物信息学方法预测这些miRNA的作用靶标。经细胞生物学实验验证后,结合结直肠癌发病分子理论,确定这些miRNA在结肠癌发病中的作用机制。这不仅丰富结肠癌的病因学及分子病理学理论,而且为结肠癌诊断、治疗提供新策略和思路。
　　研究方法:①通过文献找寻与结直肠癌发病密切相关的miRNA;根据文献报道结果,将在结直肠癌细胞内异常表达明显且较恒定的miRNA确定为本课题的初步研究对象。②通过miRNA测序和NorthernBlot等方法,检测临床结肠癌组织和细胞系中选定miRNA的表达情况(相对于正常结肠上皮组织),验证文献报道结果,确定研究对象。③通过流式细胞仪检测这些miRNA在结直肠癌细胞内过表达或低表达对结肠癌细胞的增殖、调亡或细胞周期的影响。④通过miRNA靶标预测软件KeyTar预测这些miRNA的作用靶标。⑤进一步通过荧光素酶实验(包含结合位点的突变实验)、WesternBlot等方法验证靶标预测结果。⑥结合靶标在结直肠癌发病中的作用情况,提出这些miRNA参与调节的信号传导通路,及在结直肠癌发病中的作用。
　　结果:①根据文献报道,我们发现一些在结直肠癌细胞中表达水平明显异常的miRNA,包括表达明显、恒定升高的miR-21和表达明显、恒定下降的miR-143和miR-145。②通过NorthernBlot和基因测序发现,miR-143和miR-145在临床结直肠癌组织标本内表达水平一致、明显、恒定下调。③Pre-miRNA转染结直肠癌细胞后,流式细胞仪分析显示miR-143能明显抑制肿瘤细胞的增殖;miR-145能够促进肿瘤细胞的调亡。④根据KeyTar软件预测结果,在结直肠癌发病中,miR-143的靶标分别可能为ErbB3和K-ras:miR-145的靶标为N-ras。⑤荧光索酶试验证实了ErbB3是miR-143的靶标,N-ras是miR-145的靶标。⑥WesternBlot实验结果提示miR-143可以下调结直肠癌中ErbB3和K-ras的表达,miR-145可以下调N-ras的表达,通过抑制这些癌基因的表达对结直肠癌发生、发展起着抑癌基因的作用。
　　结论:①miR-143和miR-145在临床结直肠癌组织和细胞系内的表达水平一致下调,这一实验结果与以往文献报道结果相同。②miR-143对结直肠癌细胞的增殖起到抑制作用;miR-145对结直肠癌细胞的调亡起到促进作用,这提示这两个miRNA分子在结直肠癌发病中起着抑癌基因的作用。③miR-143通过作用于ErbB3和K-rasmRNA,下调该二基因的表达水平;miR-145通过作用于Nr-asmRNA,下调该基因的表达水平。④miR-143和miR-145在染色体上基因位点非常相近,组成同一表达单位,即簇(Cluster),在肿瘤组织内表达成同步性改变。⑤它们的作用靶标ErbB3、K-ras、N—ras等是生长因子受体信号传导通路的重要组成部分,miR-143/miR-145簇可能通过抑制生长因子受体信号传导通路而发挥其抑癌基因的作用。

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写说明

前言

1 研究背景与项目情况

2 miRNA的一般情况

2.1 miRNA的生物合成过程

2.2 miRNA的作用机制

2.3 miRNA的生物学功能

2.4 miRNA与恶性肿瘤的关系

3 课题研究的提出

4 miRNA的常用研究方法及其局限性

5 问题的提出及本文创新点

5.1 问题的提出

5.2 本文的创新点和贡献

6 论文的组织结构

第一部分 miRNA在结直肠癌组织中的异常表达

1.1 结直肠癌相关miRNA的查寻

1.1.1 材料和方法

1.1.2 结果

1.2 结直肠癌相关miRNA的表达

1.2.1 主要试剂、材料

1.2.2 仪器设备

1.2.3 方法

1.2.4 结果

1.3 讨论

第二部分 miR143/miR-145在结直肠癌发病中的作用及靶标预测

2.1 miR-145对结直肠癌细胞凋亡的调节作用

2.1.1 主要试剂、材料

2.1.2 仪器设备

2.1.3 方法

2.1.4 结果

2.2 miR-143对结直肠癌细胞增殖的调节作用

2.2.1 主要试剂、材料

2.2.2 仪器设备

2.2.3 方法

2.2.4 结果

2.3 miR-145和miR-143靶标的预测

2.3.1 材料与方法

2.3.2 结果

2.4 讨论

第三部分 miR-145对结直肠癌细胞中N-ras表达的调节作用

3.1 试剂和材料

3.2 仪器设备

3.3 方法

3.3.1 pGL3-N-ras-CS、pGL3-N-ras-mutant-CS报告质粒的构建

3.3.2 细胞培养及质粒转染

3.3.3 读取荧光值

3.3.4 统计学分析

3.3.5 N-ras蛋白印迹(Western blot)

3.4 结果

3.4.1 3UTR Luciferase实验结果

3.4.2 N-ras 在结直肠癌组织及细胞系内表达水平上调

3.4.3 miR-145下调N-ras的表达

3.5 讨论

第四部分 miR-143对结直肠癌细胞中ErbB3和K-ras表达的调节作用

4.1 试剂、材料

4.2 仪器设备

4.3 方法

4.3.1 pGL3-ErbB3-CS、pGL3-ErbB3-mutant-CS报告质粒的构建

4.3.2 细胞培养及质粒转染

4.3.3 读取荧光值

4.3.4 ErbB3和K-ras蛋白印迹(Western blot)

4.4 结果

4.4.1 3UTR Luciferase 实验结果

4.4.2 ErbB3在结直肠癌中的表达水平

4.4.3 miR-143下调ErbB3的表达

4.4.4 K-ras在结直肠癌中的表达水平

4.4.5 miR-143下调K-ras的表达

4.5 讨论

论文小结

1 肿瘤相关miRNA研究存在的主要问题

2 本课题研究的内容和意义.

3 后续工作

结直肠癌相关miRNA的研究综述

1 miRNA的生物合成及功能

1.1 miRNA的生物合成过程

1.2 miRNA的作用机制

1.3 miRNA的生物学功能

2 miRNA的研究方法

2.1 miRNA的鉴定

2.2 miRNA表达水平的检测

2.3 miRNA靶标的寻找

2.4 miRNA靶标的验证

3 miRNA与肿瘤发生、发展的关系

3.1 肿瘤细胞中存住着miRNA的异常表达

3.2 miRNA的异常表达对肿瘤细胞活性的影响

3.3 miRNA的异常表达与肿瘤发生的关系密切

3.4 miRNA具有癌基因或抑癌基因的作用

3.5 miRNA的异常表达与肿瘤诊断预后密切相关

3.6 miRNA的异常表达与肿瘤浸润和转移相关

4 肿瘤细胞中miRNA表达水平改变的机制

4.1 肿瘤细胞miRNA表达异常的一般机制

4.2 表观遗传引起miRNA的表达异常

5 miRNA在结直肠癌中的研究概况

参考文献

致谢信