DNA剪切修复对MPTP/MPP+致帕金森病模型DNA氧化损伤的作用研究

摘要

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是仅次于是阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病，其主要病理特征为黑质致密部大量多巴胺能神经元变性或丢失。研究显示，PD病人黑质多巴胺能神经元内DNA氧化损伤严重，若不被及时有效的修复，则可能导致神经元死亡。在多种DNA修复机制中，最主要和最重要的是DNA剪切修复，它可以分为碱基切除修复(base excision repair，BER)和核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)。BER和NER分别依赖于多种蛋白的相互作用，其中，8-氧基-鸟嘌玲DNA糖苷酶(8-oxoguanosine DNA glycosylase，OGG1)是BER的限速因子；而着色性干皮病蛋白A、B、F、G(xeroderma pigmentosumfactor A，B，F，G，XPA，XPB，XPF，XPG)是NER不可或缺的蛋白因子；细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是BER和NER共同需要的蛋白因子；以上蛋白的表达变化分别反映了细胞内BER和NER的修复活性变化。
　　然而，在PD等神经退行性疾病病理情况下，DNA氧化损伤与DNA剪切修复的关系及其相关蛋白表达变化却仍未知。为探讨DNA氧化损伤与DNA剪切修复在PD病理机制中的作用，本论文在Mpp+(1-methyl-4-phenyl-pyridinium)致PC12细胞的PD细胞模型上采用相差显微技术和MTT实验观察了细胞的形态和活力变化，并采用Hochest染色观察细胞的凋亡情况，随后采用Western-blot技术检测了BER相关蛋白OGG1和NER相关蛋白XRA、XPB、XPF、XPG以及BER和NER共同的蛋白因子PCNA的表达变化，最后用8-oxo-7，8-dihydro-2'-deoxyguanosine(8-oxodG)免疫细胞化学染色技术研究了DNA氧化损伤情况；在MPTP(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine)致C57BL/6小鼠的PD动物模型上研究了黑质内BER和NER相关蛋白的表达变化情况，现将实验结果概述如下：
　　1.PC12细胞的形态和活力变化
　　相差显微技术的结果显示，MPP+处理不同时间对PC12细胞的形态影响不大，但是处理24h后，细胞贴壁能力降低；而MTT实验结果显示，MPP+处理PC12细胞18h和24h后，细胞活力显著下降，分别降至78.6％和70.8％。
　　2.PC12细胞的凋亡情况研究
　　我们进一步用Hochest染色来观察细胞的凋亡情况，结果显示，MPP+处理PC12细胞18h后，有凋亡细胞出现，24h后凋亡现象进一步发展，但是凋亡细胞增加并不显著，提示MPP+氧化损伤并不显著增加凋亡细胞的数目。
　　3.PC12细胞的BER和NER相关蛋白的表达变化
　　以上结果提示，Mpp+氧化损伤对细胞形态和细胞的凋亡影响不大，但却时程依赖性地使细胞活力显著降低，这可能与细胞内应对损伤的DNA修复能力降低相关；已知MPP+是特异地介导细胞DNA氧化损伤的物质，而细胞应对DNA氧化损伤的修复机制主要是DNA剪切修复，因此，我们采用Western-blot技术结合光密度分析的方法检测了MPP+处理不同时间后，PC12细胞内BER和NER相关蛋白的表达变化。光密度分析及统计结果显示，BER限速因子OGG1的表达水平在处理1h后即显著升高，比对照升高5.0倍；3h后达到高峰，升高6.4倍；之后依次下降，24h低于对照。与之对应的是，NER的各相关蛋白表达水平变化显著，XPA、XPB、XPF、XPG和PCNA在MPP+处理1h后即显著上调，分别增加4.2倍、2.0倍、2.0倍、2.7倍和1.9倍；随着MPP+处理时间的延长，各因子的表达量继续上调，其中XPA和PCNA分别在12h和3h达到高峰，分别增加3.4倍和2.5倍，而XPB、XPF和XPG均在18h到达高峰，分别增加3.4倍、3.9倍和3.9倍；24h后，各蛋白表达水平均下降，其中PCNA显著低于对照。
　　4.PC12细胞的DNA氧化损伤情况研究
　　以上结果提示，MPP+氧化损伤能上调BER和NER相关蛋白的表达水平，提示细胞内DNA剪切修复能应对DNA氧化损伤，但随着MPP+处理时间的延长，BER和NER的修复能力均下降，且细胞活力下降显著，这可能与DNA氧化损伤严重有关，因此我们进一步用8-oxodG免疫细胞化学染色来观察细胞的DNA氧化损伤。结果显示，对照细胞的8-oxodG免疫阳性细胞主要分布于线粒体，含量低；18h后，同时分布于线粒体和核，含量增多；24h后，主要集中在细胞核，含量最多，损伤最严重。结果提示，MPP+氧化损伤引起PC12细胞的DNA氧化损伤程度加剧，随着处理时间的延长，氧化损伤的标志性产物8-oxodG的分布，从线粒体逐步过渡到细胞核。推测细胞内BER和NER蛋白表达水平下降进而导致DNA剪切修复能力降低的原因是DNA氧化损伤加剧。
　　5.C57BL/6小鼠黑质内BER和NER相关蛋白的表达变化以上结果提示，在PD细胞模型上，随着DNA氧化损伤程度的改变，细胞内DNA剪切修复(BER和NER)相关蛋白表达变化显著，DNA氧化损伤加剧导致细胞BER和NER相关蛋白表达下降，DNA剪切修复能力降低。为了进一步探讨DNA氧化损伤加剧与DNA剪切修复相关蛋白的表达变化之间的关系，我们首先采用Western-blot结合光密度分析的方法检测了MPTP腹腔注射C57BL/6小鼠3d后黑质多巴胺能神经元的标志酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)的表达，结果显示TH表达显著下降，与对照相比降低63％。随后检测了BER和NER相关蛋白的表达变化。光密度分析及统计结果显示，OGG1和PCNA表达水平降低不明显，但XPA、XPB和XPG均显著下降，与对照相比，分别降低47％、58％和68％：此外，正常情况下黑质内(SN)的BER和NER相关蛋白表达的基线水平也差异显著，OGG1比对照(中脑除黑质以外的其他部位，SN-)低16倍，而XPA、XPB和XPG比SN-高1倍。以上结果提示，正常情况下黑质内BER功能低下而NER相对要高；当DNA氧化损伤加剧导致NER能力降低，可能是PD发病的原因之一。
　　小结：
　　1)在PD的细胞模型上，MPP+氧化损伤对PC12细胞的形态和凋亡情况影响不大，但显著降低细胞活力。随着MPP+处理时间延长，细胞DNA氧化损伤加剧。
　　2)在PD的细胞模型上，随DNA氧化损伤程度的增加，PC12细胞BER和NER相关蛋白的蛋白表达水平变化显著；DNA氧化损伤加剧导致BER和NER相关蛋白表达水平下降。
　　3)在PD的动物模型上，MPTP氧化损伤导致C57BL/6小鼠黑质的NER相关蛋白表达水平显著下降。
　　结论及意义：
　　在PD的细胞和动物模型上，NER相关蛋白表达水平随DNA氧化损伤程度的加剧而显著下降。结果提示，DNA氧化损伤加剧引起DNA剪切修复能力尤其是NER修复能力下降，加重了神经元的损伤并导致其死亡，这可能是PD发病机制之一。该研究可能为阐明PD病理机制及寻找新的临床治疗靶点提供新的研究基础，具有重要的理论意义和临床应用价值。