幼儿肺泡上皮和血管内皮祖细胞分离培养技术探讨

摘要

研究背景：
　　肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial typeⅡ cells，AECⅡ)是肺泡上皮的祖细胞，能够变为Ⅰ型肺泡上皮细胞参与肺损伤修复，分泌肺泡表面活性物质(Pulmonary surfactant，PS)维持肺泡稳定性、防止肺泡萎陷、保持肺的顺应性，能够将肺泡上皮顶端膜面的钠、水转运至肺间质，并参加了肺对各种吸入有害物质及微生物的天然免疫等。AECⅡ仅占肺部细胞的15％，对肺组织或肺混合细胞的培养难以明确AECⅡ的具体功能。目前尚无具有全部AECⅡ功能的细胞系，AECⅡ的原代培养成为解决这一问题的重要手段。以往研究大多是对成年大鼠、小鼠和兔AECⅡ的分离培养研究，也有少量新生动物细胞分离培养报道，但细胞产量均较低，此外由于小动物生长发育周期及生理病理过程短，生理及解剖特点也不利于长期动物实验研究，对于人新生儿至婴幼儿期的生理和病理生理学研究适用性有限。本研究的目的是建立新生猪AECⅡ分离、纯化及鉴定方法，为AECⅡ的生物学特性研究及与AECⅡ有关的在体动物实验研究奠定基础。
　　目的：
　　1、建立新生猪AECⅡ的分离、纯化及鉴定方法；
　　2、观察AECⅡ的体外生长变化特点，明确其体外实验的最佳时间。
　　方法：
　　1、取体重1000-1300 g足月新生猪肺，经气道灌入0.1％胰酶及不同浓度弹力蛋白酶与0.1％胰酶的混合酶溶液(40 u/ml elatase/0.1％trypsin、30 u/mlelatase/0.1％trypsin、20 u/ml elatase/0.1％trypsin)37℃、20 min水浴消化，收集细胞、计数细胞产量及活力；
　　2、采用percoll非连续密度梯度离心及免疫粘附法纯化(即panning法)细胞，计数细胞产量及活力；
　　3、采用透射电镜法、碱性磷酸酯酶染色法鉴定.AECⅡ；
　　4、将细胞以4×105cells/cm2接种于组织培养板，用DMEM低糖培养基(含10％胎牛血清、100 u/ml青霉素、0.1g/ml链霉素)进行培养，每24 h换液，观察细胞生长变化情况。
　　5、在相同的消化条件下：0.1％胰酶、37℃、20 min水浴消化条件下，对比研究免疫粘附法、pcrcoll非连续密度梯度离心法纯化细胞后所获得大鼠、新生猪AECⅡ的产量、活力及纯度的差别。
　　结果：
　　1、新生猪肺组织细胞的消化分离：30 u/ml弹力蛋白酶/0.1％胰酶消化肺组织后细胞产量(5.35±0.54)×106，而20 u/ml弹力蛋白酶/0.1％胰酶消化细胞产量为(3.16±0.94)×106，40 u/ml弹力蛋白酶/0.1％胰酶消化细胞产量为(3.09±0.86)×106，0.1％胰酶消化细胞产量为(2.76±0.65)×106，30 u/ml弹力蛋白酶/0.1％胰酶消化细胞产量显著高于其他3组(P<0.01)；
　　2、新生猪肺.AECⅡ的纯化：免疫粘附法纯化后的细胞产量为(37.97±27.98)×106，percoll非连续密度梯度离心法纯化细胞的产量(11.07±10.59)×106，前者明显高于后者；
　　3、新生猪肺AECⅡ的培养：原代培养24 h，AECⅡ开始贴壁，细胞呈圆形、多角形，呈岛状分布。培养至48 h，细胞形态一致，为多角形。第3-4天细胞平展，连接成细胞单层，胞浆内有大量反差明显的小颗粒，细胞核明显。第5-7天，细胞内颗粒逐渐减少，胞浆空泡，细胞体积增大，边缘模糊。AECⅡ在原代培养24-96 h处于最佳状态，此阶段适合作体外实验研究。
　　4、在相同消化、分离及纯化方法条件下，新生猪肺AECⅡ的纯化产量明显高于大鼠AECⅡ纯化产量。大鼠AECⅡ的pereoll法纯化细胞产量显著高于免疫黏附法。新生猪AECⅡ的纯化，免疫粘附法产量则明显高于pereoll法。纯化后大鼠AECⅡ的阳性率近90％，而新生猪AECⅡ的阳性率仅为70％左右。
　　结论：
　　1、新生猪AECⅡ消化分离的最佳消化条件是：30 u/ml弹力蛋白酶/0.1％胰酶联合使用，37℃、20 min消化；免疫粘附法纯化新生猪AECⅡ优于percoll法；AKP染色法是简单、实用的AECⅡ鉴定方法，细胞染色阳性率与电镜鉴定结果一致，可用于新生猪AECⅡ的鉴定。
　　2、AECⅡ体外研究的最佳时间为原代培养的第24-96 h。
　　3、在消化条件及纯化方法相同的情况下，新生猪肺AECⅡ的纯化产量明显高于大鼠AECⅡ纯化产量，AECⅡ纯度可达70％左右，可用于进一步的体外实验研究。