柴胡多糖对系统性红斑狼疮样综合征的防治作用及其对小鼠免疫功能的影响

摘要

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种累及多系统的自身免疫病,临床表现复杂。其病因和发病机制尚未完全阐明,患者最终出现机体防御能力崩溃和肾功能不全,严重影响着患者的生命。对于SLE的治疗,目前临床应用研究的是以环磷酰胺为代表的细胞毒药物和免疫抑制剂,尽管此类药物能控制病情,但其选择性差,长期应用会降低机体的防御机能,产生多种并发症和副作用。故筛选新的、毒副作用小的防治药物有重要的意义。
　　 补体与SLE病理损伤密切相关,其可能的作用机制包括:在机体清除能力受损的情况下过多的免疫复合物,可诱导补体系统过度激活。补体活化成分还是SLE病理过程中调节细胞因子产生,参与炎症反应的重要成分。补体抑制剂已成为近十年国外新药开发研究中的热点,我国药用植物资源丰富,从中获得具有补体抑制作用的免疫调节剂是完全可行的,并且可以用于治疗SLE。
　　 柴胡是我国的传统中药和常用中药,包括伞形科多年生草本植物柴胡(北柴胡)Bupleurum chinensis DC.和狭叶柴胡(南柴胡)Bupleurum seorzonerifolium Willd,具有抗炎、治疗肾病和自身免疫病的作用。小叶黑柴胡分布于我国的西北地区,在过去的研究中,我们从小叶黑柴胡根部提取出的柴胡多糖,离体研究显示出显著的抗补体活性。鉴于补体过度激活与SLE的密切关系,我们采用SLE样综合征小鼠模型,初步观察了从小叶黑柴胡根部提取出的柴胡多糖对补体相关疾病——SLE样综合征的药效;并在后续研究中初步研究了柴胡多糖的其他免疫调节作用。
　　 1柴胡多糖对系统性红斑狼疮样综合征小鼠的作用
　　 目的探讨柴胡多糖对红斑狼疮样综合征模型小鼠的防治作用。
　　 方法Day0,用含空肠弯曲菌(CJ-S131)悬液的完全福氏佐剂免疫BALB/c小鼠,Day14再用空肠弯曲菌悬液加强免疫一次,诱发小鼠红斑狼疮(SLE)样综合征;Day0-34,醋酸泼尼松(Prednisone 5mg·kg-1·d-1)、柴胡多糖(Bupleurum polysaccharides,BPs15、30 mg·kg-1·d-1)灌胃给药。观察柴胡多糖对空肠弯曲菌CJ-S131诱导的小鼠红斑狼疮样综合征的药效。检测内容包括ELISA法检测小鼠血清中总IgG、抗dsDNA抗体、抗ssDNA抗体、抗组蛋白抗体水平;通过溶血实验测定血清总补体水平;硝酸还原酶法检测血清亚硝酸盐水平以反映血清NO的水平;考马斯亮蓝法检测小鼠尿蛋白;光镜下观察药物对肾脏病理改变的影响;通过肾石蜡切片免疫组化染色(IgG),观察免疫复合物在肾小球的沉积情况;采用Image J图像分析软件对肾脏病理损伤情况进行分析。
　　 结果柴胡多糖对体重及脏器指数的影响
　　 Day14加强免疫后,与正常对照(生理盐水免疫)和模型对照组(完全弗氏佐剂免疫)相比,模型组(CJ-S131+完全弗氏佐剂免疫)小鼠的体重显著降低(P＜0.05.Day15-29)。柴胡多糖30mg·kg-1·d-1显著改善这种体重下降(P＜0.05,day15-18)。泼尼松长期给药能引起小鼠的体重显著降低(与正常组相比,P＜0.001,day35)。与正常对照组相比,模型组小鼠的脾脏、胸腺指数均显著升高(P＜0.05)。柴胡多糖30mg·kg-1·d-1显著抑制小鼠脾肿大(p=0.008)。醋酸泼尼松5mg·kg-1·d-1对模型小鼠的脾脏、胸腺指数也有显著降低作用(P＜0.001),脾指数甚至低于正常小鼠(P＜0.001)。
　　 柴胡多糖对抗自身抗体和总IgG水平的影响
　　 Day35,与正常对照和模型对照组相比,模型组小鼠的抗dsDNA、ssDNA和组蛋白抗体明显升高(P＜0.001)。与模型组相比,柴胡多糖30mg·kg-1·d-1和醋酸泼尼松5mg·kg-1·d-1对三种抗自身抗体的升高有显著改善(P＜0.01)。柴胡多糖15mg·kg-1·d-1能显著抑制血清抗ssDNA、抗组蛋白抗体水平(P＜0.001)。与正常组相比,模型对照组及模型组小鼠的血清总IgG水平显著升高(P＜0.001)。柴胡多糖和醋酸泼尼松显著抑制了总IgG的升高(P＜0.05)。
　　 柴胡多糖对血清总补体及NO水平的影响
　　 实验各组间,血清总补体活性无差异。与正常组相比,模型组小鼠的血清NO水平显著升高(P＜0.05),柴胡多糖及醋酸泼尼松给药对此无显著影响。
　　 柴胡多糖对肾损伤的影响
　　 与正常和模型对照组相比,模型组小鼠的尿蛋白水平显著增高(P＜0.01):柴胡多糖15、30mg·kg-1·d-1及醋酸泼尼松5mg·kg-1·d-1明显抑制病变小鼠尿蛋白水平的升高(P＜0.05)。
　　 光学显微镜下观察到:所有模型小鼠都有显著的肾损伤,有明显的肾小球系膜细胞增生,系膜增厚,肾小球肿胀现象。此类改变在正常组和模型对照组未见。柴胡多糖30mg·kg.d-1及醋酸泼尼松5mg·kg-1·d-1明显改善肾损害(P＜0.01,病理报告评分)。
　　 肾石蜡切片免疫组化(IgG)染色结果显示:模型小鼠的肾小球内有大量免疫复合物的沉积(黄色区域),而正常和模型对照组未见。柴胡多糖15、30mg·kg-1·d-1及醋酸泼尼松5mg·kg-1·d-1明显减少免疫复合物沉积(P＜0.001),(ImageJ图像分析软件处理结果)。
　　 2柴胡多糖对小鼠免疫功能的影响
　　 目的:研究柴胡多糖对小鼠免疫功能的影响。
　　 方法:将小鼠随机分为空白对照组、阳性对照药组、柴胡多糖2个剂量(40、20mg·kg-1)组,灌胃给药。检测药物对绵羊红细胞(SRBC)诱导的小鼠迟发型变态反应的影响;测定小鼠T、B淋巴细胞转化功能;检测药物对小鼠血清溶血素水平的影响:中性红比色法测定小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ胞饮功能,硝酸还原酶法测定巨噬细胞培养上清一氧化氮(NO)水平。
　　 结果:柴胡多糖40mg·kg-1显著抑制迟发性变态反应(P＜0.05)。柴胡多糖20mg·kg-1显著增强腹腔Mφ胞饮能力(P＜0.05);显著升高血清溶血素水平(P＜0.001),柴胡多糖刺激脾淋巴细胞增殖,并协同伴刀豆球蛋白A(ConA)促进小鼠T淋巴细胞增殖(P＜0.05)。
　　 结论:(1)柴胡多糖对小鼠红斑狼疮样综合征有防治作用;(2)柴胡多糖对小鼠免疫功能有调节作用,柴胡多糖对SLE样综合征防治作用的发挥可能与其免疫调节作用相关。