阿尔茨海默病患者全血硫胺素及其硫胺素磷酸酯衍生物含量测定与苯磷硫胺干预的研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种多发生在老年、以认知功能障碍为主要临床表现的神经退行性疾病。目前,血糖异常升高和糖尿病已被认为是痴呆和AD的独立危险因素,AD患者脑细胞葡萄糖与能量代谢显著降低、而且明显早于临床症候和特征性病理损害的形成。研究发现,AD患者与脑细胞葡萄糖和能量代谢障碍有关的酶活性异常中,仅以焦磷酸硫胺素(Thiaminepyrophosphate,TDP;硫胺素(Thiamine,T)在体内的活性形式)作为辅酶的α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,KGDH)、丙酮酸脱氢酶(pyruvatedehydrogenase,PDH)和转酮醇酶(transketolase,TK)等活性下降最为明显,且PDH和KGDH活性下降与AD临床病情评定等级高度相关。动物实验研究也显示,硫胺素缺乏促进β-淀粉状蛋白前体蛋白/早老素1(β-amyloid precursorprotein/presenilin1,APP/PS1)双转基因模型小鼠脑内Aβ沉积。提示机体硫胺素缺乏和/或代谢异常及硫胺素依赖的、与氧化代谢相关的线粒体酶活性下降可能与AD的发生发展密切相关。
　　 以往血液硫胺素测定技术复杂、干扰因素多和结果稳定性差,几乎没有医疗机构用于临床诊断分析。近年来,随着荧光检测技术的发展,发现通过铁氰化钾衍生化,可以得到相对稳定的硫胺素及其磷酸酯衍生物荧光产物,为硫胺素及其磷酸酯衍生物的检测创造了条件。正是基于上述研究背景,本课题拟通过建立精确而稳定的硫胺素及其磷酸酯衍生物高效液相色谱(high performance liquidchromatography,HPLC)荧光检测方法,对收集AD患者及其对照组全血硫胺素及其磷酸酯衍生物进行检测,明确不同年龄段健康人群硫胺素含量水平。通过比较AD患者与健康人群、其他老年疾病患者的硫胺素及其磷酸酯衍生物水平,观察AD患者是否存在硫胺素(尤其是TDP)缺乏,并判断这种缺乏是否具有特异性,为AD的诊断或者筛选提供一种可能的新思路和新途径。通过饮食添加苯磷硫胺,来观察苯磷硫胺对自然衰老小鼠学习和记忆能力改善与否,并应用免疫组化技术观察其对老年小鼠海马齿状回颗粒下层新生细胞再生的影响,为将来AD预防和治疗提供一种可能的新策略。
　　 第一部分全血硫胺素及其磷酸酯衍生物HPLC荧光检测方法的建立及AD患者全血硫胺素含量的检测
　　 目的:建立一种稳定快捷的全血硫胺素及其磷酸酯衍生物HPLC荧光检测方法,确定不同年龄段健康人群硫胺素及其磷酸酯磷酸酯衍生物含量范围,并判断AD患者是否存在硫胺素缺乏,且这种缺乏是否具有特异性。
　　 方法:血样经三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)去蛋白处理,经过铁氰化钾衍生化后,产生能被HPLC反向柱子经梯度洗脱分离的稳定地荧光产物,通过荧光检测并与硫胺素及其磷酸酯衍生物标准样本比对,来确定人体内含量。方法通过线性方程、提取率、重复性等指标验证。应用上述方法,对收集的不同年龄段健康人群、AD患者和其他疾病患者的血样进行检测。
　　 结果:经过检测,TDP、TMP、T的检测线分别为8nmol/l、1.5nmol/l和2.5nmol/l,信噪比(signal/noice,S/N)＞10,能够满足临床需要。线性趋势良好,均1)R＞0.99,三者的回收率分别为103.7％、96.8％、101.7％,重复性好,变异系数(coefficient of variability,CV)10＜％。经检测,健康人群中青年人的TDP、TMP和T的含量(nmol/l)分别为155.55±5.35、2.7±0.18和3.83±0.34,中年人分别为107.61±3.16、5.14±0.30和6.70±0.47,老年人分别为95.57±3.51、4.16±0.35和19.91±1.31。三者中TDP的含量具有差异性(P＜0.05),且随着年龄增大含量逐渐降低,而T含量随着年龄增大,进行性增加(P＜0.05)。检测发现AD患者TDP的含量明显低于健康老年人及其他疾病患者(P＜0.05),后两者相比没有差异性(P＞0.05);TMP的含量无差异;健康人群的T含量要高于患病人群。
　　 结论:经TCA去蛋白、铁氰化钾衍生、梯度洗脱建立的荧光HPLC检测硫胺素及其磷酸酯衍生物衍生物的方法可靠,可用于临床检测。健康人体全血TDP含量与年龄相关,年龄越大含量越低,而T含量随着年龄增长而同步增加。AD患者的TDP含量明显降低,且这种降低具有一定的特异性,但导致AD患者硫胺素缺乏的机制有待于进一步研究。
　　 第二部分苯磷硫胺对自然衰老小鼠认知功能影响的实验研究
　　 目的:探讨苯磷硫胺对老年小鼠学习和记忆能力的影响
　　 方法:用Y型迷宫测试12月龄Swiss小鼠后并对实验小鼠分成实验组和对照组,每组16只,分别予添加苯磷硫胺饲料(按10g/kg比例添加)和普通饲料进行喂养6个月,两组各取8只小鼠通过Y迷宫对其学习和记忆能力进行评价,剩余小鼠予BrdU(100mg/kg)腹腔注射,连续5天后,经水合氯醛麻醉,生理盐水、多聚甲醛依次灌注后取脑。免疫组化染色后观察齿状回海马颗粒下层BrdU标记阳性新生细胞数量。
　　 结果:Y迷宫检测发现,实验组小鼠在学习记忆能力均明显较对照组改善,表现为学会所需总训练次数明显减少,总反应时间明显缩短,一周后正确记忆次数明显增加(p＜0.05)。免疫组化研究发现,海马齿状回颗粒下层BrdU标记阳性的新生细胞数,实验组小鼠明显多于对照组(p＜0.05)。
　　 结论:苯磷硫胺显示出明显改善自然衰老小鼠的学习记忆能力,而海马颗粒下层新生细胞再生的增加可能是其机理之一。