强直刺激坐骨神经引起的持续性疼痛和胶质细胞的调制作用:外周和脊髓机制研究

摘要

强直电刺激大鼠坐骨神经可在脊髓背角引起场电位C反应和A反应的长时程增强(long-term potentiation,LTP)和动物的疼痛敏化。本研究以强直刺激坐骨神经诱导的大鼠慢性疼痛模型,从胶质细胞入手,主要探讨了强直刺激坐骨神经诱导的大鼠慢性疼痛的外周和脊髓机制,并在此基础上,探索针药联合镇痛的有效途径。
　　第一部分外周神经损伤和胶质细胞激活参与强直刺激坐骨神经诱导的大鼠慢性痛
　　既往研究证实,强直电刺激大鼠坐骨神经、皮肤自然伤害性刺激或神经损伤,均可在脊髓背角引起场电位C反应和A反应的长时程增强(long-term potentiation,LTP)。脊髓LTP的形成反映了痛觉信息传递的中枢敏化。已有研究证明,引起脊髓LTP的强直电刺激能引起动物的疼痛敏化,包括触诱发痛和热痛敏,但机制并不完全明确。以往的研究主要集中于脊髓水平,而对其外周机制则关注甚少。
　　近年来的研究证明,外周和脊髓的胶质细胞在病理性疼痛的发生发展中发挥重要作用。炎性痛和神经病理痛情况下均有胶质细胞的激活,而干预胶质细胞的功能可减轻病理性疼痛。
　　本研究采用伤害性机械或热刺激的痛行为学测试方法、免疫荧光组织化学方法、免疫荧光共标以及组织学染色和电镜技术,探讨强直刺激坐骨神经诱导痛行为的外周机制以及外周和脊髓胶质细胞的作用。主要结果如下:
　　1.强直刺激坐骨神经可诱导大鼠双侧触诱发痛和术侧热痛敏,分别应用vonFrey机械刺激缩腿反射和辐射热刺激缩腿反射测定。术侧触诱发痛和热痛敏可持续35天以上,并且疼痛在3周内最明显,以后逐渐缓解;而对侧触诱发痛仅持续2周左右。
　　2.免疫组织化学结果表明,强直刺激坐骨神经可诱导神经损伤标记物——转录激活因子3(activating transcription factor3 ,ATF3)在大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)感觉神经元和脊髓腹角运动神经元中表达,而在脊髓背角没有检测到ATF3的表达。DRG中ATF3的表达从强直刺激后12小时开始,第1到14天达到高峰,第35天几乎消失;同时,Fast Blue染色和电镜观察结果显示,强直刺激后坐骨神经纤维出现变性,坐骨神经刺激部位以及远端的Schwann细胞增殖,排列紊乱。这些结果均提示强直电刺激导致神经损伤。
　　3.根据ATF3与神经微丝蛋白200(Neurofilament 200,NF200;A类DRG大细胞的标记物)、异凝集素B4(Griffonia simplicifolia isolectin B4,IB4;非肽能C类神经元标记物)和降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP;肽能C类神经元标记物)的共标实验,这三类物质均与ATF3存在共标,提示这三类DRG神经元均有不同程度的损伤。
　　4.强直刺激坐骨神经引起DRG小直径C类神经元的比例发生变化,IB4阳性的C类非肽能神经元在强直刺激后第4、7与14天显著减少,CGRP阳性的C类肽能神经元在强直刺激后后第7天和第14天显著减少,而大直径A类神经元强直刺激前后改变不明显。
　　5.强直刺激坐骨神经可诱导DRG卫星胶质细胞(satellite glial cells,SGCs)的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达显著上调。GFAP在受损和未受损的神经元周围均有表达。此外,ATP敏感的配体门控离子通道受体——P2X7受体,在强直刺激坐骨神经后表达也发生上调,且与GFAP部分共标。
　　6.强直刺激坐骨神经引起脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。
　　综上所述,本研究表明,强直刺激坐骨神经可引起外周神经损伤,从而导致DRG神经元和卫星胶质细胞以及P2X7的改变,进而促进脊髓胶质细胞的激活。本研究首次揭示了强直刺激坐骨神经引起脊髓LTP和慢性痛的外周可能机制。
　　第二部分丙戊茶碱抑制脊髓胶质细胞增强电针镇痛
　　既往研究表明,胶质细胞在疼痛发生发展中发挥重要作用,干扰脊髓胶质细胞的功能可以加强电针对关节炎大鼠的镇痛作用。丙戊茶碱(propentofylline)作为一种神经保护性的胶质细胞调节剂,已被临床上用于治疗老年痴呆症和血管型痴呆等疾病。已有研究表明丙戊茶碱可抑制脊髓胶质细胞激活,减轻神经病理痛大鼠的痛行为。因此本研究建立强直刺激坐骨神经诱导的病理性疼痛模型,通过痛行为学测试、药理学方法干预、免疫荧光组织化学方法,研究电针和丙戊茶碱的协同镇痛效应。
　　行为学结果表明,强直刺激坐骨神经引起大鼠长时间的触诱发痛。在强直刺激后第7天,给予大鼠术侧环跳穴(GB30)和阳陵穴(GB34)30分钟2Hz/100Hz交替频率的电针刺激,产生明显的镇痛作用。单独鞘内给予丙戊茶碱1μg和10μg减轻触诱发痛,镇痛作用长达24小时,但0.1μg丙戊茶碱无镇痛作用。当给予0.1μg丙戊茶碱后2小时施加电针,可明显增强电针镇痛作用,镇痛效果明显优于单独电针组;1μg丙戊茶碱联合电针后镇痛效果也显著优于单独针刺组。免疫组织化学结果显示,强直刺激坐骨神经后第8天,大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞被激活,分别表现为Iba-1(小胶质细胞标记物)和GFAP(星形胶质细胞标记物)表达明显上调。事先给予丙戊茶碱1μg或10μg,Iba-1和GFAP的表达在给药后24小时较强直刺激组显著减少,但0.1μg丙戊茶碱无此效应;结果表明丙戊茶碱能够抑制强直刺激坐骨神经大鼠脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。
　　综上所述,丙戊茶碱联合电针对强直刺激坐骨神经大鼠具有协同镇痛作用,胶质细胞参与其中。