兔急性高眼压模型中有髓及无髓神经纤维的易损性研究

摘要

目的:研究急性高眼压所致的兔视网膜缺血再灌注损伤模型中无髓、有髓神经纤维的损伤程度,以及不同眼压梯度下视网膜血供的改变情况。
　　方法:成年新西兰大白兔18只,分成2组(血流动力学组、急性高眼压组),前者又分为眼底照相组(3只)和超声多普勒组(9只)。急性高眼压组6只,我们以右眼为实验组,左眼为空白对照组。每只兔均以50mg/kg氯胺酮+10mg/kg甲苯噻嗪进行肌肉注射达到全身麻醉,并采用右眼前房穿刺灌注法联合压力持续监测法,通过压力监测设备(包括压力换能器、生物信号处理系统、输出设备)实现眼压实时监测,制造精确、稳定、持续的急性高眼压模型。在建立了稳定的高眼压模型后,血流动力学组以10mmHg为单位,逐级升高眼内压至预期值(眼底照相组至70mmHg,超声多普勒组至120mmHg)并维持5min后,眼底照相组运用眼底照相的方式拍照进行影像学比较,超声多普勒组则对兔眼行超声多普勒检查,观察视网膜血供情况,并测量眼动脉峰值血流速度和阻力指数,画出相关曲线。急性高眼压组直接将眼压升至70mmHg,维持90min,然后拔去前房插管,再灌注2天后过量麻醉处死动物,迅速取下眼球,放入10％福尔马林24h后沿赤道部将眼球剪成一个视杯,然后小心地分割为鼻侧、颞侧和乳头区,分别行石蜡包埋后切片,通过髓鞘免疫组化染色,TUNEL凋亡细胞计数和电镜超微结构观察对无髓、有髓神经纤维的损伤程度进行相关研究。
　　结果:实验兔的平均体重为2.0417±0.2498kg。通过压力监测设备的应用,各眼压值均能精确稳定地维持在预先设定的眼压范围内。急性高眼压组的基础眼压在7-14mmHg之间,实验眼压:70.1569±0.9567mmHg。
　　眼底照相及眼血流超声多普勒结果:眼底血流随着眼压的不断升高而逐渐减少;在眼底照相中,可以直观的看见供应有髓神经纤维的视网膜中央动静脉管径变细,流速减慢,流量减小;同时供应无髓神经纤维的脉络膜血管也随着眼压升高而被压闭,从照片上看则主要表现为视乳头及后极部视网膜逐渐变白,血管僵硬、管壁变细。在眼血流超声多普勒中,我们首先对视网膜表面毛细血管进行了检测,结果发现正常眼压下视网膜表面可见大量毛细血管分布,逐步升高眼内压至70mmHg后视网膜表面已无法探及血流,证明大部分脉络膜毛细血管此时已被压闭,70mmHg时视网膜已发生严重缺血;而对眼动脉峰值流速(PSV)以及阻力系数(RI)的测量也表明,随着眼内压的升高,PSV逐渐下降RI逐渐增大;当IOP=70mmHg时,RI达到峰值而PSV也己明显下降;经SNK统计显示,PSV20mmHg与PSV70mmHg、RI20mmHg与RI70mmHg之间存在显著性差异(P＜0.05),故将70mmHg设为急性高眼压组的实验预期值是具有一定科学依据的。
　　髓磷脂碱性蛋白(MBP)研究结果:急性高眼压组中,对照眼与实验眼的髓鞘组织均呈现阳性染色,但相比之下实验眼的阳性染色明显较对照眼深;根据相同的转换系数将彩色图像转化成黑白图像后,对两组的透光强度进行比较,所得结果行配对t检验,得到t=5.2243,p=2.4802e-06＜0.05,证明实验组与对照组之间的MBP含量有显著性差异。结合实验数据,可知实验组MBP含量远高于对照组。
　　TUNEL视网膜凋亡细胞研究结果:急性高眼压组行TUNEL染色后,实验眼视网膜组织各层均可见大量凋亡细胞,对照眼仅查见个别阳性细胞,两组间的细胞凋亡率有显著性差异(p＜0.01);而实验眼的有髓神经区与无髓神经区相比,细胞凋亡率为31.81％±16.26％和57.29％±17.47％,前者明显低于后者;经三个重复测量因素的析因分析后,证明两区之间确有显著性差异(p＜0.05),且无髓区损伤重于有髓区;进一步对视网膜各层细胞分别行统计分析后,发现节细胞与双极细胞的凋亡率有着显著性差异(p＜0.05),但两者与光感受器细胞的凋亡率之间,并无显著的统计学意义(P＞0.05)。
　　电镜视网膜超微结构观察结果:镜下可见髓鞘组织变薄,结构紊乱,有些可见板层松散。轴突肿胀,轴膜与髓鞘间腔隙形成,局部断裂。轴浆密度降低,颗粒状变性。微管、微丝数量减少。线粒体肿胀,出现空泡样变,证明急性高眼压所致的缺血再灌注可致视网膜各层细胞受损,轴突、髓鞘变性,且该损伤是通过启动细胞凋亡程序实现的,具有不可逆转性。进一步比较有髓区和无髓区的损伤程度,发现有髓区各层结构相较于无髓区受损程度稍轻。
　　结论:眼内压达70mmHg时兔眼视网膜已发生严重缺血;当IOP=70mmHg时,RI达到峰值且PSV明显下降,故将该值设为急性高眼压组的眼压高值;维持兔高眼压模型90min后再灌注2d将导致视神经髓鞘组织与视网膜各层细胞的损伤,可见髓鞘组织内MBP的含量增加,电镜下见视网膜各层细胞凋亡,其中又以无髓区较为严重,可见在兔急性高眼压所致的视网膜缺血再灌注损伤中,髓鞘可能具有一定的保护视神经作用,该作用机制可能为多种因素的综合。