纳米图案化仿细胞外基质表面的制备及细胞黏附行为的研究

摘要

细胞行为与基底材料的化学-机械特征密切相关。人们开始认识到,组织修复材料表面的纳米特征是决定细胞黏附等行为和创伤愈合效果的关键因素之一。近年来,各种各样以特异性细胞黏附配体(如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列,简称RGD)修饰的生物材料不断被开发出来用于仿细胞外基质的研究。其中,将含RGD序列的配体分子在抗细胞黏附背景材料中进行空间排列的方法为从分子水平上考察细胞与胞外基质相互作用提供了有效的手段。这方面的研究工作仍有一些非常重要的问题值得我们探讨,特别是“配体分子空间排列的规整度如何影响细胞黏附等行为”至今未曾有文献报道。
　　本论文工作的目的就是构建纳米图案化的仿细胞外基质模型,即在抗细胞黏附的聚乙二醇(PEG)基底上构筑环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D苯丙氨酸-赖氨酸[c(RGDfK)]多肽分子组成的规则与不规则平行对照的纳米阵列,用于考察这种整联蛋白(integrin)特异性识别的配体分子在纳米尺度上的空间排列对于细胞黏附行为的影响。这是首次将RGD纳米阵列的规整度对细胞产生的影响进行具体量化的考察。另一方面,为了初步考察细胞对材料本体机械性能的响应,本文设计了纳米图案化硬质基底和聚合物基底两种仿细胞外基质材料体系。
　　论文的主要创新性工作为:
　　(一)提出了一种在硬质基底表面利用两亲性嵌段共聚物胶束自组装模板制备规则与不规则平行对照的纳米金阵列的方法。本文采用最新拓展的高分子胶束自组装模板法(添加规整度干扰剂),在玻璃、硅晶片等无机材料表面制备出一系列尺寸和规整度可调的纳米金颗粒的阵列。我们系统考察了各种实验因素对纳米金阵列特征参量(间距、规整度、密度、颗粒直径)的影响,实现了纳米金阵列在纳米尺度上的灵活调控。另外,本文还设计了对纳米金阵列形貌进行统计分析的新方法和软件。
　　(二)基于上述纳米图案的细胞实验发现,特异性细胞黏附需要活性配体的成簇分布,其相邻分子的间距一般应当小于～70nm。本文的重点部分是具有细胞黏附反差的纳米图案化硬质基底材料表面的制备和相关细胞黏附行为的考察。通过对玻片表面进行抗细胞黏附处理即接枝聚乙二醇硅烷化试剂(PEG-Silane)和对纳米金阵列进行c(RGDfK)多肽分子修饰,成功地制备出具有细胞黏附反差的纳米图案化硬质基底材料。由于c(RGDfK)多肽与整联蛋白的特异性结合,使得纳米金阵列或多肽阵列的原始排列直接反映了细胞聚焦黏附(focaladhesion)的黏着斑复合体结构中单个整联蛋白分子的横向排列方式。通过对细胞黏附行为的平行对照考察,实验结果显示,在多肽配体平均间距大于～70nm时,多肽阵列的规整度对细胞黏附有重要的影响。通过首次采用平行对照的不规则的多肽纳米阵列,本文将c(RGDfK)多肽位点平均密度和局部位点间距成功地去耦合,验证了多肽配体局部临界间距(～70nm)的存在,在这一临界间距以上,细胞黏附及黏着斑复合体的形成严重受到抑制。并且发现,在不规则的多肽纳米阵列上,较低的多肽位点平均密度就可以导致稳定而有效的细胞聚焦黏附。与此相关的细胞生物学机理也在文中进行了阐述。
　　(三)PEG水凝胶表面纳米图案的制备和细胞黏附行为研究。本文采用最新拓展的图案转移技术,与c(RGDfK)多肽分子修饰方法相结合,在PEG水凝胶材料表面制备出具有细胞黏附反差的多肽纳米阵列图案。PEG水凝胶的本体机械性能可以通过改变其聚合物网络的交联密度进行调节。本文采用冷冻扫描电镜表征了各种纳米图案化水凝胶材料的表面形貌,并对材料其他性能也进行了表征。初步解释了实验相关的机理。在此基础上,本文初步考察了PEG水凝胶表面多肽纳米阵列的形貌和材料本体软硬度对细胞黏附行为的影响。
　　总之,本文开发的纳米图案化仿细胞外基质材料为考察细胞行为提供了新颖、实用的研究模型,并且对于从分子水平上考察细胞与材料相互作用机制、优化新式纳米生物医用材料的设计等具有积极意义。