基于角膜上皮细胞培养模型的眼用制剂角膜透过性及毒性研究

摘要

目前对于眼用制剂角膜透过机制及毒性研究，传统的整体动物实验和离体角膜－扩散池法，存在处死动物数量多、个体差异大等缺点。细胞水平的筛选及评价已渐渐成为研究的热点。本文的目的是采用人角膜上皮细胞培养模型(HCECs)对模型药物的角膜透过性及毒性进行研究，对眼用制剂细胞水平的研究和评价方法进行探索。
　　 一、建立了用于药物角膜透过性研究的角膜上皮细胞培养模型，并应用于模型药物6-羧基荧光素和罗丹明B的角膜透过性研究。将HCECs 接种于Transwell-clear 培养板，采用DMEM/F-12 培养液进行培养，通过MilliporeMillicell-ERS电阻仪测定不同时间的细胞跨膜电阻值，观察其细胞形态，评价了该细胞模型的致密性及细胞间紧密连接，测定模型药物6-羧基荧光素和罗丹明B对角膜上皮细胞的渗透值。结果显示，跨膜电阻值随培养时间的延长而增加，15d 达到最大值，约为180 Ω·cm2。此时通过显微镜观察角膜上皮细胞长成致密的复层结构。渗透性实验表明，亲水性6-羧基荧光素和亲脂性罗丹明B在HCECs 角膜上皮细胞培养模型的渗透系数分别为(1.12±0.40)×10-6cm·s-1和(18.30±3.05)×10-6cm·s-1，渗透性比值为16。在离体兔角膜模型测得的渗透系数分别为(1.07±0.50)×10-6cm·s-1和(25.40±7.03)×10-6cm·s-1，渗透性比值为24。表明HCECs 角膜上皮细胞培养模型具备角膜细胞的完整性、致密性以及胞间紧密连接，可用于药物角膜透过性评价。
　　 二、建立了用于细胞毒性研究的角膜上皮细胞培养模型，并应用于新型药物载体树状大分子PAMAM及葛根素对角膜上皮细胞的毒性研究。采用WST-1法分别测定了PAMAM、葛根素、葛根素-PAMAM 复合物及葛根素脂质体在不同浓度和不同时间对HCECs的细胞存活率的影响及各自的IC50值。结果表明，随着PAMAM 代数的增加，角膜上皮细胞毒性增加，在一定浓度范围之内角膜上皮细胞毒性随着药物浓度的增加而增加，且角膜上皮细胞毒性随着药物接触时间的延长而增加。半代的PAMAM 角膜上皮细胞毒性均低于整代PAMAM。葛根素-PAMAM 复合物及葛根素脂质体角膜上皮细胞毒性高于葛根素本身。研究提示，低代或半代的PAMAM 可能更适合作为眼部药物给药的载体，也可考虑采用结构修饰等手段降低高代PAMAM 角膜上皮细胞毒性。