淀粉样蛋白结合醇脱氢酶(ABAD)基因缺陷对小鼠脑及SK细胞线粒体功能的影响

摘要

阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统变性疾病，以进行性多项认知损害为主要表现的综合征。患者脑中三大病理特征为淀粉样蛋白(Aβ)沉积、神经纤维缠结及神经元丢失。近年来细胞内Aβ、线粒体功能紊乱在AD发病中的作用已成为研究热点。
　　 淀粉样蛋白结合醇脱氢酶(ABAD)位于线粒体基质，催化醛、酮、醇及类固醇等的氧化或还原。Aβ存在时，Aβ可与ABAD结合，使后者构象改变，引起细胞内氧化应激可致细胞死亡。而无Aβ环境下，ABAD在应激情况下对机体有保护作用。
　　 为更好研究ABAD与Aβ结合后在AD发病中的作用及ABAD本身的生理作用，建立ABAD基因敲除小鼠模型是一研究基础。目前已成功新建立神经元内选择性ABAD基因敲除小鼠模型。本实验对该小鼠一般性状、特征，及线粒体功能，且对于引起人类MHBDD疾病的ABAD三个突变位点进行了初步的研究，为ABAD在线粒体内的功能提供一些线索。
　　 第一部分选择性ABAD基因敲除对小鼠神经细胞及其线粒体功能影响的初步研究
　　 目的：选择性神经元内ABAD基因敲除小鼠(ABAD ko小鼠)是新建立的小鼠模型，需要明确其基本特征及神经细胞线粒体功能。探索神经元内ABAD表达量下降导致线粒体功能紊乱的可能原因。
　　 方法：使用CREB PCR及FLOX MR鉴定ABAD ko小鼠基因型。使用westernblot及免疫荧光染色鉴定ABAD在其大脑皮层及海马表达量。TMRM荧光染色了解线粒体膜电位变化，MitoSOX荧光染色观察线粒体氧自由基的释放，用ATP试剂盒测定脑组织ATP含量，TUNEL试剂盒染色观察神经细胞凋亡情况。免疫荧光染色及Western blot观察MHB、CypD及其它多种蛋白表达量的改变。用ImageJ对Western blot条带及荧光染色进行量化，通过标准曲线换算ATP脑组织含量，对TUNEL阳性的细胞及神经元进行计数等，用student t test比较基因敲除小鼠与对照小鼠的差异。
　　 结果：ABAD ko小鼠基因型为CREB(+)且FLOXΔAneo。Western Blot结果提示ABAD ko小鼠皮层及海马ABAD的表达量明显下降，密度值分别为皮层0.81±0.129 vs.0.29±0.031，P=0.00098，海马1.74±0.144 vs.1.00±0.160，P=0.01894。免疫荧光染色提示ABAD ko小鼠上述部位ABAD表达量下降。MHB染色发现ABAD ko小鼠皮层MHB较wt小鼠明显增多，密度值为11.14±0.609 vs。6.92±0.354，P=0.018，海马中ABAD ko小鼠MHB密度值较wt小鼠高，但P=0.48，无统计学差异。ABAD ko小鼠内嗅皮层中TMRM染色明显减低(1.00±0.081 vs。0.75±0.049，P=0.036)，运动感觉皮层无明显降低(P=0.754)。MitoSOX染色在ABAD ko小鼠内嗅皮层中明显升高(1.00±0.062 vs.1.37±0.085，P=0.004)，而在运动感觉皮层无统计学差异(P=0.336)。脑组织ATP含量测定ABAD ko小鼠数值相对低，但两组小鼠无统计学差异，可能取脑时间及部位不同影响结果(wt小鼠脑ATP含量2.54±0.282，ABAD ko小鼠ATP含量2.11±0.210，P=0.264)。TUNEL染色发现7-8月ABAD ko小鼠皮层及海马均有TUNEL阳性细胞，较对照组明显升高，且内嗅皮层区神经元与总神经细胞比值明显下降，提示有神经元丢失(ABAD ko小鼠内嗅皮层神经元与总细胞比值0.298±0.069，wt小鼠0.67±0.050，P=0.032)，而3-5个月的ABAD ko及wt小鼠大脑皮层或海马中均无TUNEL阳性染色，且皮层运动感觉区及内嗅皮层均无明显神经元丢失。另外Westernblot结果发现CypD、nrf2、SODII、GFAP在ABAD ko小鼠脑组织中明显升高，COXIV、PSD95、Synaptophysin等表达量明显下降。
　　 结论：ABAD ko小鼠的基因型为CREB(+)且FLOX△neo，皮层及海马神经元中ABAD表达量明显降低，其底物MHB在上述部位堆积，为导致下游膜电位下降，ROS增多及细胞凋亡的原因之一。ABAD ko小鼠脑中CypD表达量升高，可能为导致线粒体功能紊乱的另一原因。ABAD ko小鼠大脑皮层中内嗅皮层损伤严重。GFAP，SoDII，Nrf2表达量上升，可能与星形胶质细胞增生对抗细胞内氧化应激有关，PSD95、Synaptophysin表达量降低，提示突触功能受影响。
　　 第二部分 ABAD及三种突变体对氧化应激损害反应的研究
　　 目的：人类疾病MHBDD是由ABAD基因某些位点的点突变引起。既往认为是突变造成ABAD对MHB酶活性下降导致MHB在脑内堆积引起发病，而最近有报道认为还有其它途径损伤线粒体。因此，本研究建立空载体转染、wtABAD转染及三个mutABAD转染的稳定细胞系，观察wtABAD及三种突变体对氧化应激损害的反应，研究ABAD突变引起线粒体功能紊乱的可能途径。
　　 方法：建立稳定表达的空载体，wtABAD，三个mutABAD(R130C，D86G，Q165H)的SK-N-SH细胞系。用Western blot检验ABAD表达量，AEC染色鉴定细胞形态及纯度。选出合适的克隆后，加入H2O2诱导氧化应激，用MTT试剂盒、ATP试剂盒，测定各个细胞系中细胞的存活、生长及细胞内ATP含量的变化。两组间MTT数值及ATP含量差异用student t test检验。
　　 结果：wtABAD组与空载体转染的对照相比，H2O2处理24小时浓度为25uM，50uM，100uM组及处理48小时浓度为25uM，50uM组，MTT值明显升高(P<0.05)。wtABAD转染的ABAD表达量不同的克隆里，对氧化应激均具有明显保护作用，且ABAD表达量低，保护作用相对好，H2O2浓度高时保护作用更明显。mutABAD组里，100uM H2O2处理细胞24小时后MTT发现，R130C及Q165G组MTT值与对照相比无统计学意义差异(R130C：0.80±0.033 vs.0.73±0.059，P=0.340；Q165H：0.80±0.033 vs.0.89±0.050，P=0.162)，D86G组数值明显下降(0.80±0.033 vs。0.48±0.011，P=0.011)。250uM H2O2处理细胞24小时后MTT发现，D86G、R130C数值明显下降(D86G：0.50±0.076 vs.0.08±0.002，P=0.001；R130C：0.50±0.076 vs.0.15±0.021，P=0.001)，Q165H数值上升(0.50±0.076 vs.0.69±0.019，P=0.030)。
　　 ATP结果提示H2O2100uM，200uM处理24小时后，对照组ATP含量较wtABAD组明显降低(100uM：0.90±0.086 vs.1.18±0.079，P=0.036:200uM：0.66±0.071 vs.1.07±0.092，P=0.006)。50uM H2O2处理，wtABAD至48小时ATP含量无明显下降，而对照组ATP含量明显下降(24hr：1.01±0.066 vs.0.95±0.081，P=0.391；48hr：0.83±0.032 vs.1.05±0.071，P=0.036)。而三个mutABAO组，100uM及200uM H2O2处理细胞24小时后测定ATP发现，ATP值与对照相比均无明显升高。
　　 结论：H2O2引起的氧化应激情况下，wtABAD转染SK细胞克隆对细胞均有保护作用，而三种mutABAD转染的细胞，MTT结果提示D86G、R130C可能对细胞存在进一步损伤作用，Q165H可能存在保护作用，ATP含量同对照组无明显差异。推测突变通过影响其它底物酶活性或CypD相关途径对线粒体功能产生损害，需要进一步实验证实。