自噬溶酶体通路及泛素蛋白酶体通路在肝癌药物干预中的相关作用研究

摘要

前言：原发性肝癌(以下简称肝癌)是中国最常见的恶性肿瘤之一，每年全世界新发肝癌病例的55％发生在我国，而大部分肝癌病人在诊断明确1年内死亡。其原因在于很多肿瘤到晚期时才被发现，而此时已经无法根治性切除。因此这些病人只能选择化疗、放疗或者介入治疗，但是效果却很差，五年生存率仅为7％。而对于曾行根治性切除术的肝癌患者，术后的高复发率也需要积极有效的药物辅助治疗才能达到更佳的临床疗效。
　　 然而肝癌的药物治疗进展一直不大，单药治疗有效率低，且毒副作用大。近年来，一些新型药物如口服5-FU的前体药物卡培他滨、第三代铂类药物奥沙利铂等相继成功用于临床，使肝癌的化疗出现了新的进展。而随着分子靶向型药物如索拉非尼(Sorafenib)的出现，肝癌的药物治疗更是呈现出新的局面。然而尽管如此，大宗的随机分组临床研究报道这些药物也仅能延长晚期肝癌患者很短的生存期。因此发展新的化疗药物或化疗策略进一步提高肝癌疗效已是当务之急。
　　 进展期肿瘤的一个重要特点是旺盛的蛋白质合成和降解，两者对肿瘤的生长都必不可少。泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)和自噬溶酶体系统(autophagy-lysosomal system，autophagy)是真核细胞内两条主要的蛋白质降解途径。前者主要负责降解信号分子、肿瘤抑制因子、细胞周期蛋白、凋亡抑制因子等。蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitors)通过抑制蛋白酶体的功能，干扰细胞原有的增殖、分化和凋亡过程，可以优先在恶性转化的细胞中诱导凋亡，使人们逐渐意识到其抗肿瘤的潜能。近年来，蛋白酶体抑制剂发展迅速，硼酸肽类药物硼替佐米(bortezomib)已用于临床多发性骨髓瘤的治疗。但是蛋白酶体抑制剂在实体瘤的应用发展缓慢，在肝癌方面研究极少。
　　 抵抗化疗药物诱导的凋亡是肿瘤细胞的重要特性之一，也是导致其耐药或者复发、转移的重要原因。有研究提示另外一条蛋白质降解通路：自噬溶酶体蛋白降解通路(简称自噬通路或自噬溶酶体通路)在体内激活并作为细胞的一种保护机制可能在其中起了重要作用。凋亡通路和自噬通路的信号途径相互交错影响，相互依存，因此决定肿瘤细胞的命运。所谓自噬溶酶体通路是以细胞内双层或多层膜样结构包裹胞浆或细胞器形成自噬小泡为形态学特征，然后通过与细胞内溶酶体融合而降解囊泡内容物。自噬溶酶体通路是细胞内除了泛素蛋白酶体通路以外最重要的降解体系，负责降解长寿蛋白质、老化细胞器、RNA及其它大分子，生命体借此维持代谢平衡及内环境稳定。因此人们认为自噬溶酶体通路通过降解陈旧细胞器或者长寿蛋白，有利于肿瘤细胞逃避缺乏营养或者药物治疗等应激环境。相反如果抑制了自噬通路，则会导致肿瘤细胞大量死亡。同时也有研究认为过度上调的自噬通路可以引起细胞内蛋白过度降解而死亡，即“自噬性细胞死亡”，也称为Ⅱ型程序化细胞死亡。因此调控自噬通路有望成为进一步提高药物疗效新的途径。
　　 本课题分别从肝癌细胞系、肝癌裸鼠模型和肝癌临床组织样本三个水平，深入研究药物直接激活肝癌自噬溶酶体通路的现象及机制，探索自噬、自噬性细胞死亡及凋亡在药物干预治疗中的交互作用及其分子机制。同时初步探索细胞内两条蛋白降解通路之间的交互影响，了解蛋白酶体抑制剂在肝癌应用中的可行性和方法学，最终为肝癌的药物治疗提供新的选择，为联合用药提供理论基础，也为进一步提高肝癌的化疗疗效提供新的思路。
　　 第一部分、自噬溶酶体通路在蛋白酶体抑制剂抗肝癌中的体外研究
　　 包括肝癌等恶性肿瘤中都存在泛素蛋白酶体蛋白通路变异，将泛素蛋白酶体通路作为干预靶点是治疗恶性肿瘤新的方向，同时研究发现自噬溶酶体通路与泛素蛋白酶体通路可能存在互补代偿的关系。本部分拟在体外初步探索阻断泛素蛋白酶体通路后对肝癌的抗肿瘤作用，了解自噬溶酶体通路与泛素蛋白酶体通路在体外的客观联系，并进一步明确自噬溶酶体通路在蛋白酶体抑制剂抗肝癌中所发挥的确切作用。
　　 选用两种不同类别的蛋白酶体抑制剂MG-132(醛肽类)和bortezomib(硼酸肽类)，两种不同作用机制的自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)和chloroquine(CQ)，选用三种具有不同凋亡抵抗和侵袭转移潜能的肝癌细胞系：MHCC-97H，PLC/PRF/5和Huh-7(MHCC-97H>PLC/PRF/5>Huh-7)。用MTT法检测增殖；Hoechst33342染色并.Annexin-V-FITC和propidium iodide(PI)双染，流式细胞仪分析检测凋亡；用Western blot检测自噬关键蛋白Beclin-1和LC3的表达，以及稳定转染的GFP-LC3检测自噬。最后用RNAi沉默自噬关键基因Atg5的表达抑制自噬，再用MG-132和bortezomib干预三种肝癌细胞系后检测凋亡，更直接地明确自噬通路在其中所发挥的作用。
　　 结果发现，两种蛋白酶体抑制剂MG-132和bortezomib对三种肝癌细胞系MHCC-97H，PLC/PRF/5和Huh-7都有一定的抑制增殖和诱导凋亡作用，量效曲线呈浓度依赖性和时间依赖性。其中Huh-7最敏感，在一定浓度作用下，达到半数致死量需36h，而MHCC-97H最抵抗，半数致死量需60h，PLC/PRF/5居中，需48h。同时MG-132和bortezomib都可以在三种肝癌细胞系中激活自噬。当用两种自噬抑制剂CQ或3-MA抑制自噬通路后，MG-132或bortezomib在三种肝癌细胞系中诱导的凋亡细胞都显著增多(P<0.05)。最后用RNAi沉默自噬关键基因Atg5的表达抑制自噬活性后，再用MG-132和bortezomib干预，凋亡的细胞仍增多(P<0.05)。
　　 体外研究初步表明，将泛素蛋白酶体通路作为干预靶点有望成为治疗肝癌新的方法。同时蛋白酶体抑制剂的使用将激活自噬溶酶体通路，后者作为代偿机制发挥保护肿瘤细胞的作用。通过调控(抑制)自噬通路活性可增强蛋白酶体抑制剂对肿瘤细胞的杀伤作用。
　　 第二部分、自噬溶酶体通路在硼替佐米抗肝癌中的体内研究
　　 蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)已被美国FDA批准用于血液系统多发性骨髓瘤和套状淋巴瘤的临床治疗。然而，蛋白酶体抑制剂在众多实体瘤(如胃癌，胰腺癌等)中的临床前期研究却发现效果不佳。在前一部分我们已初步证实了bortezomib在体外对肝癌有确切的抑制增殖和诱导凋亡的效果，同时自噬溶酶体通路被激活发挥保护肿瘤细胞的作用。考虑自噬激活可能是实体瘤对bortezomib抵抗的原因之一，因此我们将针对上述两条蛋白降解通路，在体内进一步研究。
　　 选用在体外较抵抗的MHCC-97H和体外较敏感的Huh-7两种肝癌细胞系，按常规建立MHCC-97H裸鼠原位肝癌模型和Huh-7皮下肝癌模型。两种模型每种24只均随机分为四组，术后第三天经腹腔注射分别给予saline，CO，bortezomib，CQ联合bortezomib。第35天处死裸鼠，计算每组肿瘤平均体积。两种模型各组再行免疫组化技术：Tunel染色检测凋亡，Ki-67染色检测增殖，P62染色检测自噬。同时各组制作电镜切片，进一步明确凋亡和自噬情况。
　　 结果发现，35天后在体外敏感的Huh-7皮下瘤，bortezomib组的平均肿瘤体积与对照组相比，无明显统计学差异(P=0.85)；而在体外相对抵抗的MHCC-97H原位瘤，bortezomib组平均肿瘤体积与对照组相比显著减小(P<0.05)。当联合CQ抑制自噬后，两种模型平均肿瘤体积均较单用bortezomib显著减小(P<0.05)。Tunel染色发现，单用bortezomib在MHCC-97H原位瘤和Huh-7皮下瘤都显著诱导凋亡，与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。Ki-67染色提示bortezomib使MHCC-97H的增殖指数显著下降(P<0.05)，而对Huh-7皮下瘤未见明显的抗增殖效果，当联合CQ后较单用bortezomib诱导凋亡和抗增殖效果均更显著(P<0.05)。P62染色提示在两种肝癌模型体内，bortezomib均可在一定程度上激活自噬，而CQ可以抑制这种效应。透射电镜更提供了bortezomib在两种肝癌模型中诱导凋亡，激活自噬以及CQ抑制自噬的直接证据。
　　 体内研究结果表明蛋白酶体抑制剂bortezomib能够抑制MHCC-97H裸鼠肝脏原位成瘤，却无法抑制Huh-7裸鼠皮下成瘤。结合其他研究结果，我们认为原因可能在于MHCC-97H原位瘤比Huh-7皮下瘤有更丰富的血供，继而导致差异性的肿瘤血液灌注和药物暴露。因此，我们认为蛋白酶体抑制剂bortezomib具有一定的抗肝癌作用，而采用经肝动脉插管化疗的方式有望达到其在肝癌治疗中的最佳疗效。此外，本项研究证实在体内自噬溶酶体通路同样被激活而发挥保护性作用，而应用自噬抑制剂CQ能够增强bortezomib的体内抗肝癌效果。
　　 第三部分、自噬溶酶体通路在奥沙利铂抗肝癌中的体内外研究
　　 在肝癌的临床治疗中，对于尚无远处转移但又不能一期切除的大肝癌常使用化疗药物经肝动脉插管灌注的方式令其转变为可切除的小肝癌，再行手术。但仍有相当部分患者并不能达到预期的肿瘤缩减效果。我们在体外和体内业已证实在蛋白酶体抑制剂抗肝癌中，自噬溶酶体通路被激活而发挥保护性作用，那么在其他肝癌的常规化疗中，可能也存在同样的规律。同时，自噬保护肿瘤细胞免于凋亡的可能机制值得探索。而对于曾行肝动脉插管化疗的临床肝癌患者，其肿瘤组织中自噬活性是否确实升高，我们将继续研究以明确。
　　 选用常规化疗药物奥沙利铂(oxaliplatin)，两种自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)和chloroquine(CQ)，抗氧化剂N-acetyl-cysteine(NAC)。选用两种肝癌细胞系：SMMC-7721和Huh-7。用Western blot检测自噬关键蛋白LC3的表达，以及稳定转染的GFP-LC3，透射电镜检测自噬；Annexin-V-FITC和propidiumiodide(PI)双染，流式细胞仪检测凋亡。2’，7’-dichloro-fluorescein diacetate染色，流式细胞仪检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平。建立Huh-7裸鼠皮下肝癌模型，随机分为四组，术后第三天经腹腔注射分别给予saline，CQ，oxaliplatin，CQ联合oxaliplatin，第35天处死裸鼠，计算每组肿瘤平均体积。各组取瘤组织免疫组化LC3染色检测自噬，Tunel染色检测凋亡。取40例石蜡包埋的临床肝癌组织标本(20例曾行局部化疗，20例未行)，另加10例正常肝组织，免疫组化LC3染色检测分析各组自噬活性。
　　 结果发现，在体内和体外，oxaliplatin在诱导肝癌细胞凋亡的同时也激活自噬溶酶体通路，且自噬同样发挥保护性作用。而在抑制自噬通路的同时予抗氧化剂NAC，凋亡细胞数量减少，提示抑制自噬后凋亡增加可能与细胞内ROS水平升高有关。LC3免疫组化分析亦提示曾行局部化疗的肝癌组织较未行组自噬活性显著升高(P=0.002)。
　　 本部分研究进一步表明，在肝癌接受化疗药物治疗时，自噬溶酶体通路被激活且发挥保护性作用具有一定的普遍性，可通过调控自噬通路以增加化疗效果。抑制自噬后细胞内蛋白质聚积、线粒体功能障碍进而导致ROS水平增加可能是凋亡增加的机制。曾行局部化疗的肝癌组织自噬活性升高，提示临床用药使肿瘤缩减效果不佳可能与激活的自噬保护作用相关，化疗药物与自噬抑制剂CQ联用值得行进一步临床试验。
　　 结论：
　　 1.将泛素蛋白酶体通路作为干预靶点有望成为治疗肝癌新的方法，自噬溶酶体通路是与其功能代偿互补的系统，通过调控(抑制)自噬通路活性可增强蛋白酶体抑制剂对肿瘤细胞的杀伤作用。
　　 2.蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)在实体瘤中的作用不应仅局限于用作其他化疗药物的辅助制剂，其抗肿瘤效果依赖于较好的肿瘤血液灌注和有效药物暴露。因此bortezomib具有一定的抗肝癌作用，采用经肝动脉插管化疗的方式有望达到其在肝癌治疗中的最佳疗效。
　　 3.在肝癌接受化疗药物治疗时，自噬溶酶体通路被激活且发挥保护性作用具有一定的普遍性，可通过调控自噬通路以增加化疗效果。抑制自噬后细胞内蛋白质聚积、线粒体功能障碍进而导致活性氧簇(ROS)水平升高可能是凋亡增加的机制。
　　 创新点：
　　 1.首次在肝癌细胞系内探索将泛素蛋白酶体通路作为干预靶点治疗肝癌的可行性，并在肝癌裸鼠模型水平探索了蛋白酶体抑制剂硼替佐米在肝癌中的适用性，初步明确了其在实体瘤中的应用条件，拓宽了其应用范围。
　　 2.首次从肝癌细胞系、肝癌裸鼠模型和肝癌临床组织样本三个水平，明确了在接受化疗中自噬溶酶体通路被激活并发挥保护性作用的现象和机制，为临床联合用药提供理论基础。
　　 潜在应用价值：
　　 1.本研究有助于将泛素蛋白酶体系统在肝癌中的应用引入更深入的层次。
　　 2.本研究为蛋白酶体抑制剂硼替佐米在肝癌中的实际应用提供理论和试验基础。
　　 3.抑制自噬溶酶体通路后将增强化疗药物效果具有一定普遍性，联合自噬抑制剂(如氯喹)和其他化疗药治疗肝癌以及其他肿瘤具有一定的临床应用前景。