组装抑制蛋白Profilin1促进星状孢菌素诱导的乳腺癌细胞凋亡及其分子机制的研究

摘要

Profilin1(Pfn1)，又称骨架蛋白结合蛋白1，是进化上高度保守的一种肌动蛋白结合蛋白(actin-binding proteins，ABPs)；它可以通过调节肌动蛋白单体(G-actin)的多聚化和解聚，引起纤维型肌动蛋白(F-actin)的动态变化，从而参与调控肌动蛋白骨架的重塑，在细胞黏附，运动，生长等生物学行为中发挥着重要的作用。很多文献证实当细胞恶变时，伴随细胞迁移侵袭能力的增强同时出现ABPs表达的异常改变；而在哺乳动物肿瘤细胞(乳腺癌，肝癌、胰腺癌及鼻咽癌等)中发现，Pfn1表达的部分缺失与肿瘤恶性表型密切相关，过表达外源性Pfn1的乳腺癌细胞与对照细胞相比，细胞形态和骨架重构发生改变，细胞生长速度减慢，粘附性增强，更易形成上皮样结构，且其在异位或原位裸鼠模型中的成瘤作用明显受到抑制。这些结果均提示Pfn1可能具有抑癌作用，但其发挥抑癌作用的分子机制目前并不是很清楚。
　　 本实验室前期工作运用双向电泳和质谱等技术探讨了诱导分化剂视黄酸对人肝癌细胞的作用机制，差异蛋白质表达谱进行比对分析发现Pfn1为其中一种表达上调的蛋白质，进一步的研究表明Pfn1参与了全反式视黄酸对癌细胞增殖和迁移的抑制，其抑制作用可能部分通过上调Pfn1的蛋白表达水平来介导的。因此，我们认为Pfn1也许可以成为阻断肿瘤转移的某些步骤的靶点。由于目前已知的化疗药物和植物提取物治疗肿瘤的主要机制是诱导肿瘤细胞凋亡，这提示Pfn1可能对肿瘤细胞凋亡过程产生影响。前期研究发现天然诱导分化剂星状孢菌素(Staurosporine，STS)也能够上调乳腺肿瘤细胞中Pfn1的蛋白水平，这提示我们Pfn1在STS诱导的凋亡模型中可能起到关键的作用。STS是一种广谱的蛋白激酶抑制剂，能够诱导多种肿瘤细胞系发生凋亡，因此已被用于进行凋亡模型的建立。那么Pfn1在STS诱导的凋亡事件中发挥什么样的功能呢?在本研究中我们证实了Pfn1能够促进STS诱导的乳腺癌细胞的凋亡，并在此基础上深入探讨了Pfn1促进细胞凋亡及其抑癌作用的分子机制。
　　 已有研究表明在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等组织中Pfn1的表达低于正常组织。为了探讨Pfn1在其它肿瘤组织中的表达情况，我们选取了大肠癌(包括结肠癌和直肠癌)肿瘤组织及癌旁组织或远端(3cm以上)组织进行Pfn1表达的免疫组织化学差异性分析，发现正常组织中Pfn1的表达比肿瘤组织高，这与在乳腺及肝脏组织中的已有报道是一致的。同时，各种组织来源的肿瘤细胞中Pfn1蛋白水平的比较证实Pfn1在乳腺癌中的表达是比较低的，且明显低于正常的乳腺细胞。我们筛选了几种乳腺癌细胞中Pfn1表达相对最低的MDA-MB-468这一恶性程度较高的乳腺癌细胞系为对象，构建了Pfn1过表达的稳定转染细胞株(Pfn1-468)研究发现，Pfn1的过表达能够明显增强乳腺癌细胞对STS诱导的细胞凋亡的敏感性。根据文献报道STS诱导细胞凋亡的主要机理是引发氧化应激反应并引起线粒体的损伤。本文发现在STS作用下，Pfn1过表达能够显著降低乳腺癌细胞的生存率，使处于亚G1期的细胞明显增多，并促使核分裂相的出现，DNA的断裂降解，表明凋亡增强。线粒体膜电位的改变是凋亡早期的主要特征之一，Pfn1过表达后促进了线粒体膜电位的下降，使得细胞色素C释放增多，从而引起内源性途径凋亡酶caspase3、9活性的增加以及级联反应的发生，从而促进了多聚腺苷酸聚合酶(PARP)的剪切。这些研究结果说明Pfn1能够增强STS引发的细胞内凋亡途径即线粒体途径的细胞凋亡。
　　 Caspase的活化需要线粒体释放细胞凋亡酶激活因子。Pfn1的过表达是否影响细胞内线粒体凋亡激活因子的改变以及其促进凋亡的分子机制目前并没有报道。我们发现外源性Pfn1的过表达能够上调乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞内凋亡激活因子p53的水平。目前已知近半数的乳腺癌细胞中存在的是突变型p53，且突变位点大多位于其DNA结合结构域，因此丧失了转录依赖的细胞凋亡激活功能。而MDA-MB-468细胞中含有的正是上述突变型的p53蛋白。进一步的研究发现STS促进了突变型p53在细胞质中的定位，并激活其15位丝氨酸的磷酸化，促进活化型p53在线粒体的聚集。这些结果提示突变型p53可能参与了STS诱导的细胞凋亡过程。而Pfn1的过表达对这一过程起到正调控的作用。然后，免疫共沉淀及免疫荧光实验证实Pfn1能够与突变型p53相互作用并能促进突变型p53在细胞质的定位。以上结果提示Pfn1通过调控p53发挥转录非依赖的促凋亡功能从而增加了细胞对STS诱导的凋亡的敏感性，这可能是其发挥促凋亡功能的机制之一。
　　 Pfn1作为一个构架蛋白，与肌动蛋白及细胞膜表面蛋白有着密切的联系，可通过与actin相关的细胞骨架而参与细胞黏附、生长、分裂以及信号转导等多种细胞功能。在我们的研究中发现，Pfn1在乳腺癌细胞中的过表达能够上调整合蛋白β1亚基(Integrinβ1)的蛋白水平。已知整合蛋白是一类重要的细胞表面黏附分子，可以调节细胞增殖、分化和凋亡等许多基本生物学功能；而β1亚基在肝癌细胞中的过表达能够引起S期的阻滞，导致细胞增殖的抑制。这提示整合蛋白β1可能是Pfn1发挥促凋亡以及抑癌功能的另一个靶点。进一步的研究显示Pfn1过表达能够增加β1整合蛋白在细胞中的稳定性，并能够促进Pfnl-actin-Integrinβ1复合物的形成。在STS凋亡模型中，β1整合蛋白的下调或者actin骨架结构的破坏都能够抑制Pfn1过表达所引起的促凋亡功能。这些结果提示β1亚基参与了Pfn1对STS诱导的细胞凋亡的增敏作用。成熟的整合蛋白分子为异二聚体，β1亚基需要与相应的α亚基结合成为二聚体才能定位在细胞膜上发挥其生物学功能。我们发现Pfn1过表达上调β1的同时也上调了α5亚基的蛋白水平。而受体整合蛋白α5β1的配体纤连蛋白(Fibronectin，FN)能够逆转Pfn1过表达所诱导的促凋亡作用，因此Pfn1过表达所引起的整合蛋白受体与其配体间的相对缺乏可能是其促进细胞凋亡的另一个重要的机制。
　　 实验室前期研究证实了整合蛋白β1亚基过表达可抑制人肝癌细胞株SMMC-7721的细胞增殖，并诱导细胞周期阻滞，而且此细胞周期阻滞现象与细胞周期抑制性调控蛋白p21和p27的表达密切相关。为了深入探讨整合蛋白β1发挥抑癌功能的分子机制，本文首先在多种组织来源的肿瘤细胞系中验证了整合蛋白β1过表达对细胞增殖的抑制作用，并发现p21是整合蛋白β1亚基过表达所导致的细胞周期S期阻滞和增殖抑制的一个关键因子；β1亚基过表达主要通过降低c-Jun的水平从而促进p21基因的转录激活。同时我们发现整合蛋白β1亚基过表达可以在不同组织来源的肿瘤细胞中诱导不同类型的α亚基表达，其中α5亚基的增多在β1亚基过表达引起的细胞周期阻滞和增殖抑制过程中起重要作用。细胞外基质(ECM)的相对缺乏可能是整合蛋白β1亚基过表达引起细胞增殖抑制和细胞周期阻滞的重要因素。