基因突变对细菌视紫红质功能的影响及相关功能材料研究

摘要

二十一世纪是生命科学高速发展的世纪。生命科学不仅自身得到了快速发展，生命科学和材料科学的结合还有助于增强生命物质相关的特殊功能材料的研发。细菌视紫红质(简称BR)是一种将光能转换成化学能或生理信号的光响应蛋白质，稳定存在于紫膜(PM)当中，有望作为一种具备光响应特性的功能材料的基本成份。作为视黄醛蛋白质家族新成员，古细菌视紫红质(简称AR4)与BR具有相似的结构和功能。两者功能上的差异凸显了结构与功能之间的密切关系。如何进一步阐明其内在关系，又能同时开展相关功能材料的基础研究，是目前视黄醛膜蛋白分子研究的重点之一。
　　 本博士论文以分子生物学技术为基础，从生物和材料交叉学科的角度入手，通过比较两种视黄醛蛋白质BR和AR4之间的差异，一方面尝试获得新的稳定基因突变体揭示视黄醛蛋白质内在的结构与功能的特性，另一方面运用突变体蛋白质与合成高分子复合制备光信息存储膜及蛋白质光感受器微阵列的原型材料。此外，还探索了细菌视紫红质紫膜的新功能。
　　 本论文的主要创造性工作为：
　　 (一)通过比较两种视黄醛蛋白质BR和AR4一级结构的差异，运用基因工程定点突变方法，设计并获得包括K41E和D102K等六个新的BR突变体。通过对突变体性能的研究，排除了第41位赖氨酸和第102位天冬氨酸是决定质子提取释放顺序反向的关键氨基酸，并证实质子释放基团(PRC)的pKa值决定质子提取释放的顺序。虽然这两个带电荷的残基并不是BR和AR4中影响质子提取释放顺序的关键氨基酸，但是这些突变体确实对光循环产生了影响，比如降低了D96的质子亲和能力以及质子从质子通道向D96的传递速率。此外与野生BR相比，突变体中D102K光循环中M中间态和质子提取的时间延长3倍。因此这些残基可能涉及内部质子供体对质子的提取和释放。
　　 (二)制备了第96位天冬氨酸被缬氨酸取代的BR突变体D96V及其高分子复合膜，并进行了相关基础研究。通过基因工程方法，在本身不表达BR的嗜盐菌L33中实现了新突变体D96V的表达。具有强疏水性的缬氨酸取代天冬氨酸后，所得突变体蛋白质仍然具有光学响应。与野生型BR相比，中性的盐溶液环境中突变体D96V的M态寿命延长近两个数量级，有利于未来作为信息材料使用。将此突变体蛋白质与合成高分子聚乙烯醇(PVA)混合后制备得到蛋白质/聚合物复合功能膜，M态寿命比液体条件下又有显著的延长。此外，我们还发现D96V中间态的寿命对于体系的含水量具有较高的敏感性。
　　 (三)发现该蛋白质形成的紫膜具有一种新功能--抗细胞黏附，并进一步联合生物、化学和物理的方法制备了具有细胞黏附反差的视蛋白光感受器微阵列。将小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1、小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞等哺乳动物细胞接种到紫膜表面培养，发现紫膜具有强烈的抗拒细胞黏附的作用。接种细胞无法在紫膜上黏附、铺展，并且紫膜对细胞黏附具有长时间的抵抗效果。这样提供了一种崭新的既有光学响应、又抗污的天然大分子。另一方面，采用基因工程点突变方法引入半胱氨酸取代BR中第36位的天冬氨酸，从而使原本不带巯基的BR的表面获得巯基，并与金产生共价连接，增强了微阵列的稳定性和分辨率。利用电沉积法，包含BR和磷脂的紫膜膜片在直流电场中统一取向后附着在金微米阵列上。BR膜一旦靠近金电极，巯基与金即形成共价键。紫膜各层之间则利用偶联剂使相邻层之间形成化学交联，在保证其高度稳定性的同时显著增强蛋白质微阵列的光电信号。物理附着的BR蛋白质分子最终被表面活性剂Triton X-100清除，即得到结构稳定且单点分布的蛋白质微阵列。取向的视蛋白不仅保留了生物活性，光激发后还能产生累加的电信号。这样，我们所得到的微图案不仅具有细胞黏附反差，而且其中的“像素”也具有光学响应性。设计的这种单点控制，单点接受信息的光感微阵列器件在光电领域有潜在的应用前景，也可为其它蛋白质芯片的制备提供借鉴。