双配体与聚乙二醇修饰增强聚合物纳米载体肿瘤靶向功效

摘要

纳米载体肿瘤靶向给药可提高抗肿瘤药物疗效、降低毒副作用。特异性配体修饰可实现肿瘤细胞或组织对纳米载体的主动识别，增强主动靶向功效。亲水性聚合物修饰可延长纳米载体的血液循环时间，增强被动靶向功效。表面修饰可改变纳米载体的理化性质、蛋白吸附、药物释放速率、细胞摄取和体内分布等。本文研究双配体与聚乙二醇(PEG)修饰对纳米载体理化性质和体内外肿瘤靶向功效的影响。
　　亚油酸聚苹果酸双接枝壳聚糖(LMC)水中可自组装形成纳米粒，LMC经表面修饰制备主动靶向纳米粒，包括:生物素(BT)修饰的LMC纳米粒(BT-LMC纳米粒)、叶酸(FA)修饰的LMC纳米粒(FA-LMC纳米粒)、FA和BT双修饰的LMC纳米粒（FA，BT-LMC纳米粒）和不同密度PEG修饰的FA-LMC纳米粒（低密度:PEG1，FA-LMC纳米粒;中密度:PEG2，FA-LMC纳米粒;高密度-PEG3，FA-LMC纳米粒）。研究单配体、双配体和不同密度PEG修饰对纳米粒理化性质和体内外肿瘤靶向功效的影响。
　　红外光谱(FTIR)和核磁共振(1H NMR)研究表明BT、FA和PEG接枝至LMC纳米粒;BT在BT-LMC纳米粒和FA，BT-LMC纳米粒中的取代度(DS)为7.5％，FA在FA-LMC纳米粒、FA，BT-LMC纳米粒和PEG修饰FA-LMC纳米粒中的DS分别为7.5％、4.9％和7.5％，PEG在PEG1，FA-LMC纳米粒、PEG2，FA-LMC纳米粒和PEG3，FA-LMC纳米粒中的DS分别为3.7％、8.9％和15.1％。BT修饰可增大LMC纳米粒的粒径、减少表面电荷;FA修饰后LMC纳米粒的粒径和表面电荷无显著变化。FA，BT-LMC纳米粒的表面电荷较单配体修饰纳米粒少，表明双配体修饰可减少纳米粒的表面电荷。FA-LMC纳米粒的粒径随PEG修饰密度的升高而增大，表面电荷随PEG修饰密度的升高而降低。接触角表征纳米粒亲水性，BT-LMC纳米粒和FA-LMC纳米粒的接触角均显著小于LMC纳米粒(P＜0.01)，FA，BT-LMC纳米粒的接触角显著小于单配体修饰LMC纳米粒(P＜0.05)，FA-LMC纳米粒的接触角随PEG修饰密度的升高而减小，表明配体和PEG修饰可增强纳米粒的亲水性。
　　以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白考察表面修饰对纳米粒蛋白吸附的影响，BT-LMC纳米粒、FA-LMC纳米粒和FA，BT-LMC纳米粒的蛋白吸附量分别为LMC纳米粒的60.2％、59.1％和85.3％，FA-LMC纳米粒的蛋白吸附量随PEG修饰密度的升高而降低，表明配体和PEG修饰可降低纳米粒的蛋白吸附量。以紫杉醇(PTX)为模型药物考察表面修饰对纳米粒释药速率的影响，LMC纳米粒、BT-LMC纳米粒、FA-LMC纳米粒和FA，BT-LMC纳米粒12 h的累积释药百分率分别为79.8％、58.7％、69.7％和40.2％; PEG1，FA-LMC纳米粒、PEG2，FA-LMC纳米粒和PEG3，FA-LMC纳米粒12 h的累计释药百分率分别为61.1％、40.4％和22.0％，表明配体和PEG修饰可降低纳米粒的释药速率。
　　细胞摄取试验考察表面修饰对纳米粒体外肿瘤靶向功效的影响。制备罗丹明B标记的纳米粒，考察肿瘤细胞(SMMC-7721)、正常细胞(L02)和巨噬细胞(Raw264.7)对纳米粒的摄取。结果表明SMMC-7721细胞对BT-LMC纳米粒、FA-LMC纳米粒和FA，BT-LMC纳米粒的摄取分别为LMC纳米粒的1.6、2.4和3.0倍;双配体修饰后L02细胞对纳米粒的摄取减少，表明配体修饰可增强纳米粒的体外肿瘤细胞靶向功效，双配体修饰纳米粒的肿瘤细胞靶向功效优于单配体修饰纳米粒。Raw264.7细胞对纳米粒的摄取从高到低依次为:FA，BT-LMC纳米粒＞FA-LMC纳米粒＞BT-LMC纳米粒＞LMC纳米粒，表明配体修饰可增加巨噬细胞对纳米粒的摄取。FA-LMC纳米粒的细胞摄取随PEG修饰密度的升高而降低;PEG3，FA-LMC纳米粒在SMMC-7721、L02和Raw264.7细胞中的摄取分别为FA-LMC纳米粒的24.2％、8.9％和27.1％，表明PEG修饰减少细胞对纳米粒的摄取。
　　H22荷瘤小鼠抑瘤率(TIR)和组织分布试验考察表面修饰对纳米粒体内肿瘤靶向功效的影响，结果表明BT-LMC纳米粒、FA-LMC纳米粒和FA，BT-LMC纳米粒的TIR分别为LMC纳米粒的1.4、1.3和1.6倍，肿瘤组织PTX相对摄取率（Re）分别为LMC纳米粒的1.1、1.2和1.3倍，可见配体修饰可增强纳米粒的体内肿瘤靶向功效，双配体修饰纳米粒的肿瘤靶向功效优于单配体修饰纳米粒。PEG修饰FA-LMC纳米粒的TIR从高到底依次为:PEG2，FA-LMC纳米粒＞PEG3，FA-LMC纳米粒＞PEG1，FA-LMC纳米粒＞FA-LMC纳米粒;PEG1，FA-LMC纳米粒、PEG2，FA-LMC纳米粒和PEG3，FA-LMC纳米粒的肿瘤组织PTX Re分别为FA-LMC纳米粒的1.2、1.5和1.5倍，表明合理的PEG修饰密度可增强配体修饰纳米粒的肿瘤靶向功效。

目录

摘要

前言

1 材料与仪器

2 实验方法

2．1 LMC及其衍生物纳米粒的制备

2．1．1 LMC纳米粒的制备

2．1．2 叶酸修饰LMC纳米粒的制备

2．1．3 生物素修饰LMC纳米粒的制备

2．1．4 叶酸和生物素双修饰LMC纳米粒的制备

2．1．5 PEG醛的制备

2．1．6 PEG醛的活化率

2．1．7 PEG修饰FA-LMC纳米粒的制备

2．1．8 罗丹明B标记纳米粒的制备

2．2 LMC及其衍生物的表征

2．2．1 红外光谱(FTIR)

2．2．2 核磁共振(1H NMR)

2．2．3 示差扫描量热(DSC)

2．2．4 接触角

2．2．5 粒径和表面电荷

2．3 蛋白吸附

2．4 载PTX纳米粒的载药量、包封率及体外释放

2．4．1 色谱分析条件

2．4．2 标准曲线

2．4．3 载PTX纳米粒的制备

2．4．4 载药量和包封率测定

2．4．5 载PTX纳米粒的体外释药

2．5 细胞试验

2．5．1 肿瘤细胞对纳米粒的摄取

2．5．2 游离配体对肿瘤细胞摄取的影响

2．5．3 正常细胞对纳米粒的摄取

2．5．4 巨噬细胞对纳米粒的摄取

2．5．5 MTT试验

2．6 载PTX纳米粒对H22荷瘤小鼠的抑瘤率效果及组织分布

2．6．1 H22荷瘤小鼠模型的建立

2．6．2 抑瘤试验

2．6．3 组织样品处理

2．6．4 色谱分析条件

2．6．5 方法专属性

2．6．6 标准曲线与检测限

2．6．7 精密度与回收率

2．6．8 载PTX纳米粒在荷瘤小鼠体内的组织分布

2．7 统计学分析

3 结果与讨论

3．1 LMC及其衍生物的表征

3．1．1 红外光谱(FTIR)

3．1．2 核磁共振(1H NMR)

3．1．3 DSC

3．1．4 粒径

3．1．5 表面电荷

3．1．6 接触角

3．2 蛋白吸附

3．3 载PTX纳米粒的载药量、包封率及体外释放

3．3．1 标准曲线

3．3．2 载药量和包封率

3．3．3 载PTX纳米粒的体外释放

3．4 细胞试验

3．4．1 肿瘤细胞摄取

3．4．2 正常细胞摄取

3．4．3 巨噬细胞摄取

3．4．4 MTT试验

3．5 抑瘤试验

3．5．1 肿瘤生长曲线

3．5．2 抑瘤率

3．6 组织分布试验

3．6．1 组织样品处理

3．6．2 方法专属性

3．6．3 标准曲线

3．6．4 回收率与精密度

3．6．5 荷瘤小鼠体内组织分布

总结和展望

参考文献

致谢

个人简历

纳米载体的表面修饰及其在肿瘤靶向中的应用

声明