超支化纳米载体转基因修饰骨骼肌成肌细胞治疗缺血性心脏病的研究

摘要

第一部分小鼠成体骨骼肌成肌细胞提取及纯化方法的改进
　　 研究背景：
　　 作为成体种子细胞及基因治疗工程细胞，高纯度骨骼肌成肌细胞(skeletalmyoblasts，SkMs)在缺血性心脏病的治疗中展示了良好的临床应用前景。如何快速、高效、经济地获取足量的高纯度SkMs一直在不断地进行摸索、改进。
　　 研究目的：
　　 建立一种快速、高效的小鼠成体SkMs提取、纯化的实验方法。
　　 研究方法：
　　 通过布比卡因预处理激活肌骨骼肌中的SkMs，48h后，配制优化混合酶，通过一步消化分离法及改良纯化法，从成年骨骼肌中分离高纯度SkMs，并与普通差速贴壁法、反复差速贴壁法及Percoll非连续密度梯度离心法等传统纯化方法分离的SkMs的纯度相比较。
　　 研究结果：
　　 通过改良提取、纯化法所得到的SkMs纯度可达到92.59±1.29％，明显高于普通差速贴壁法、反复差速贴壁法及Percoll非连续密度梯度离心法(P＜0.05)，并具有很好的增殖及分化能力。
　　 研究结论：
　　 通过采用改良成体SkMs提取及纯化法，能快速高效地获取高纯度SkMs。
　　 第二部分新型超支化聚酰胺胺纳米载体介导基因转染的研究
　　 研究背景：
　　 基因治疗正逐步被应用于多种疾病的防治，前景十分广阔。而在基因转染的过程中，最关键的核心问题是如何选择理想的基因载体。
　　 研究目的：
　　 探讨一种新型的非病毒基因载体--超支化聚酰胺胺(hyperbranchedpolyamidoamine，h-PAMAM)纳米颗粒在基因转染中的效率、毒性及转染后的基因表达情况。
　　 研究方法：
　　 以“改良-锅法”合成h-PAMAM纳米颗粒，将核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)及h-PAMAM以不同的质量比复合构建h-PAMAM-DNA复合物，观察其粒径大小及Zeta电位情况；在核酸内切酶的作用下，观察纳米颗粒对质粒的保护作用；以h-PAMAM-DNA复合物转染COS7及HEK293细胞系，测定在不同质量比情况下的转染效率及细胞存活率，得出最优化的转染方案；h-PAMAM介导的人血管内皮生长因子165(human vascular endothelial growth factor165，hVEG165)基因转染后，测定hVEG165基因在转染后的表达情况。
　　 研究结果：
　　 h-PAMAM-DNA复合物的粒径及zeta电位随着h-PAMAM/DNA质量比的增加而提高，h-PAMAM能保护质粒不受核酸内切酶的消化，保持其完整性和稳定性长达2小时。h-PAMAM介导质粒转染时，最佳转染条件下，转染效率可达47.47±1.42％(COS7细胞)及40.8±0.98％(HEK293细胞)，此时细胞毒性较轻微，细胞存活率较高(COS7:91.38±0.46％；HEK293:92.38±0.61％)；h-PAMAM介导的hVEG165基因转染后，hVEG165能表达14天之久，峰值出现在第2天。
　　 研究结论：
　　 作为一种新型非病毒基因载体，h-PAMAM介导了一种经济、高效、安全的基因治疗方法。
　　 第三部分新型超支化聚酰胺胺介导低氧调控血管内皮生长因子基因转染技术协同骨骼肌成肌细胞移植治疗缺血性心脏病
　　 研究背景：
　　 骨骼肌成肌细胞(skeletal myoblasts，SkMs)移植协同血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)基因治疗是一种有潜力的治疗缺血性心脏病的方案。然而，有待优化的基因载体及不可调控的血管内皮生长因子的表达阻碍了基因治疗的应用。因此，寻求一种经济、高效、可控的基因转染平台非常是有必要的。
　　 研究目的：
　　 本实验中，我们探讨了超支化聚酰胺胺(hyperbranched polyamidoamine，h-PAMAM)纳米颗粒介导的低氧可调控性人血管内皮生长因子165(hypoxiaregulated human vascular endothelial growth factor，HRE-hVEGF165)基因转染协同SkMs移植治疗缺血性心脏病的可行性及有效性。
　　 研究方法：
　　 将核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)及h-PAMAM纳米颗粒以不同的质量比复合构建h-PAMAM-DNA复合物，以复合物转染SkMs，测定在不同质量比情况下的转染效率及细胞存活率，得出最优化的转染方案；免疫染色、Realtime-PCR及Elisa法测定其基因转染后的表达情况。将h-PAMAM-HRE-hVEGF165复合物修饰的SkMs移植至C57/BL6小鼠的缺血心肌中，探讨心肌细胞凋亡情况，移植干细胞存活率，心梗面积及胶原沉积，血管密度及心功能。
　　 研究结果：
　　 h-PAMAM介导质粒转染SkMs时，最佳转染条件下，转染效率可达43.47±2.22％，此时细胞毒性较轻微，细胞存活率较高(91.38±0.48％)。在低氧情况下，h-PAMAM介导的HRE-hVEG165基因转染时能表达hVEGF165基因18天之久。h-PAMAM-pHRE-hVEG165修饰的SkMs移植至缺血心肌后，过表达的VEGF可导致心肌凋亡的减少，移植成肌细胞存活率的增加，梗死面积及胶原沉积的减少，血管密度的增加，从而抑制左室的重构，提高了心功能。
　　 研究结论：
　　 h-PAMAM介导的HRE-hVEGF165基因转染SkMs是可行、有效的，并且是一种新型的有前景的缺血性心脏病的基因治疗策略。