飞秒激光角膜基质透镜切除(ReLEx)创伤愈合及机制研究

摘要

第一部分飞秒激光角膜基质透镜切除(ReLEx)角膜愈合实验研究
　　 目的:探讨飞秒激光角膜基质透镜切除(ReLEx)角膜愈合过程中的组织形态变化规律。
　　 方法:健康成年新西兰大白兔21只，分为A组12只，B组9只，分别行飞秒激光LASIK与小切口透镜切除(SMILE)，设置的屈光矫正度数均为-6.00DS/-1.00DC。随机选取一眼作为术眼，另取未手术的3眼作为空白对照。采用扫描电子显微镜对SMILE组术中取得的基质内透镜及飞秒激光LASIK组角膜瓣及基质床进行表面光滑度观察。术后裂隙灯显微镜密切观察角膜愈合情况，于术后1周、1月、3月分别进行光镜观察和透射电子显微镜(TEM)观察角膜基质细胞形态结构变化。
　　 结果:两组手术均较顺利完成，所有术眼角膜实现了Ⅰ期愈合，SMILE组术后水肿较飞秒激光LASIK组更快消退。光学显微镜检查结果显示，术后1周时SMILE组中央区角膜水肿程度轻于飞秒激光LASIK组，层间可见清晰间隙，飞秒激光LASIK组角膜瓣与基质床粘合，两组胶原纤维排列稍紊乱，切口边缘可见上皮栓形成；术后1月时，两组中央区角膜水肿均基本消退，基质层胶原纤维的排列较1周时更加规则，SMILE组基质层间间隙基本贴合。术后3月时，两组中央区角膜各层结构基本完好，基质层胶原纤维排列较规则。TEM检查结果表明，术后1周及1月时两组角膜基质细胞可表现为线粒体肿胀，术后3月时两组角膜基质细胞基本恢复正常，胶原纤维排列规则。扫描电子显微镜检查结果表明，飞秒激光LASIK组角膜角膜瓣及基质床表面均具有较高的平滑度，SMILE组角膜基质内透镜正背两面的光滑程度均较理想，正面的光滑度优于背面。
　　 结论:飞秒激光可安全完成较光滑的基质透镜；ReLEx术后角膜的创伤愈合反应优于飞秒激光LASIK，ReLEx术后早期层间间隙的临床意义有待进一步探讨。
　　 第二部分飞秒激光角膜基质透镜切除(ReLEx)角膜基质细胞凋亡的研究
　　 目的:探讨飞秒激光角膜基质透镜切除(ReLEx)术后早期角膜基质细胞凋亡的特点。
　　 方法:健康成年新西兰大白兔24只，分为A、B两组，各12只，分别行飞秒激光LASIK和SMILE手术，设置的屈光矫正度数均为-6.00DS/-1.00DC。随机选取一眼作为术眼，另取未手术的6眼作为空白对照。于术后4h和24h取材，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标法(TUNEL)检测角膜基质细胞的凋亡水平，并制作角膜超薄切片行TEM检查观察角膜基质细胞的形态改变。
　　 结果:正常对照组未见TUNEL阳性细胞的表达。两组中央区角膜均出现TUNEL阳性细胞，飞秒激光LASIK组主要分布于角膜瓣与基质床的交界面，SMILE组主要分布于角膜帽与下方基质床的交界面。术后4h及24 h时，飞秒激光LASIK组凋亡细胞数均明显高于SMILE组，差异有统计学意义(P<0.01)。TEM检查结果表明，术后4h及24h时两组角膜基质中均可见凋亡或明显损伤改变的细胞。
　　 结论:ReLEx引起的角膜基质细胞凋亡水平低于飞秒激光LASIK，可能与小切口及不需要掀开角膜帽有关。
　　 第三部分飞秒激光角膜基质透镜切除(ReLEx)角膜基质细胞增殖炎症反应研究
　　 目的:探讨飞秒激光角膜基质透镜切除(ReLEx)术后角膜细胞增殖炎症反应特点。
　　 方法:健康成年新西兰大白兔48只，分为A、B两组，各24只，分别行飞秒激光LASIK和SMILE手术，设置的屈光矫正度数均为-6.00DS/-1.00DC。随机选取一眼作为术眼，另取未手术6眼作为空白对照。于术后1d、3d、1周和1月取材，用于免疫荧光染色检测Ki-67及CD11b的表达。
　　 结果:K1-67免疫荧光结果显示，正常对照组角膜Ki-67仅在上皮层表达，两组术后中央区角膜基质均出现Ki-67阳性细胞，主要分布于层间基质切开层面。SMILE组角膜基质Ki-67阳性细胞数低于飞秒激光LASIK组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后3d时Ki-67阳性细胞数最高，术后1周时两组均减少，术后1月时两组角膜基质中Ki-67的表达均很少。CD11b免疫荧光结果显示，正常对照组角膜未见有CD11b阳性细胞的表达；两组术后中央区角膜基质均出现CD11b阳性细胞，飞秒激光LASIK组主要分布于角膜瓣与基质床的交界面，SMILE组主要分布于角膜帽与下方基质床的交界面。各时间点SMILE组CD11b阳性细胞的表达量低于飞秒激光LASIK组，差异具有统计学意义(P<0.01)。
　　 结论:ReLEx术后角膜增殖炎症反应较飞秒激光LASIK轻，可能与小切口以及不掀开角膜帽有关。
　　 第四部分飞秒激光制作基质袋辅助角膜胶原交联的实验研究
　　 目的:探讨飞秒激光辅助角膜胶原交联术后角膜修复特点。
　　 方法:10只健康新西兰白兔，予以右眼接受飞秒激光辅助角膜胶原交联术。飞秒激光制作直径7mm，厚度80μm的角膜基质袋，角膜基质袋内注入0.1％的核黄素液后进行A波紫外光的交联。设定的紫外光辐射强度为3mW/cm2，共照射10min。术后裂隙灯显微镜密切观察角膜愈合情况，采用Pentacam分析术前及术后1天、1周、2周、1月、3月、6月时的角膜地形图及中央角膜厚度(central corneal thickness，CCT)变化，并观察Scheimpflug前节图像的特点。术后6月时制作角膜HE染色切片观察组织病理改变。
　　 结果:术后1d时，所有兔均能自然睁闭眼，活动自如。所有术眼角膜均愈合良好。术后6h时，角膜基质袋下潜在腔隙清晰可见，在术后3d时基本弥合；术后2周时，10眼中8眼角膜基质出现分界线，分界线前角膜基质反光密度高于后方基质；术后1月时，角膜情况稳定，浅层基质反光密度有所减弱。整个观察期内晶状体始终保持透明。CCT在术后1天达峰值后逐渐减少，在术后1月至最低值。术后3月及6月时的CCT值再次恢复至较高的水平。除术后1月外，各观察点的CCT均显著高于术前值(P<0.05)。角膜地形图显示，手术区角膜前表面在术后第1天变陡，术后1周即明显改善，并在随后的观察期内呈现逐渐变平坦。术后1月时，10眼中的8眼Scheimpflug像即可观察到基质内分界线样改变。病理学检查提示，发生交联与未交联的角膜基质间存在明显分界，分界线前角膜基质呈现水合腔隙样改变。
　　 结论:飞秒激光辅助角膜胶原交联是安全的术式，术后角膜修复快，基质内分界线可作为交联术后早期角膜的临床观察体征。
　　 第五部分飞秒激光角膜基质透镜切除(ReLEx)临床研究
　　 目的:探讨飞秒激光角膜基质透镜切除(ReLEx)临床效果及安全性。
　　 方法:前瞻性连续病例研究。在伦理委员会同意下，入选12例(12眼)，平均年龄(32.7±10.5)岁(范围18岁～53岁)，裸眼远视力0.05-0.2，最佳矫正视力0.6-1.0，等效球镜(-6.97±1.36)DS(范围为-4.88DS～-9.50DS)，中央角膜厚度(528.92±26.64)μm(范围为488μm～578μm)。常规围手术期检查。术后1d、7d、1个月、3个月、6个月随访检测视力、屈光度数、像差等，术后3个月内裂隙灯显微镜密切观察角膜愈合情况，并于术后1d、1周、1月和3月采用前节OCT观察角膜创面的愈合情况，并选择5例于术后1周、1月和3月采用共焦显微镜观察角膜伤口的愈合情况。
　　 结果:飞秒激光透镜切除术中顺利，裂隙灯显微镜观察术后1d时中央区角膜轻度水肿，角膜瓣边缘可见“双环征”，术后1月时角膜表现出较好的透明度，瓣缘“双环”清晰并呈轻微瘢痕化；术后3月时角膜情况稳定。末次随访裸眼远视力提高至0.6～1.2，最佳矫正视力0.7～1.2，其中较术前提高2行或以上2只眼，提高1行3只眼，不变7只眼，无最佳矫正视力下降者。术眼屈光度与目标屈光度的差值均在(+0.75～-0.75)DS内。前节OCT检查提示术后1d时浅层角膜基质轻度水肿，角膜瓣的厚度均匀，术后1周时浅层角膜水肿信号明显减弱，术后1月及3月时术眼角膜情况均较稳定，前基质层角膜水肿已不明显。共焦显微镜检查发现所有术眼均出现不同程度的前弹力层及浅基质层的微皱褶，术后1周时中央区角膜交界面可见基质结构模糊，并可见激活的细胞及形态不一的高反光颗粒。透镜边缘区可见明显皱褶，角膜瓣边缘可见角膜上皮细胞的填充；术后1月时角膜层间激活的细胞数有所下降，透镜边缘区结构稳定，角膜瓣边缘相邻基质呈强反光纤维化改变；术后3月时角膜层间激活的细胞数较1月时进一步减少，透镜边缘开始轻度纤维化的改变，角膜瓣边缘附近基质更趋瘢痕化。
　　 结论:ReLEx矫正近视安全有效，术后角膜可平稳修复并在术后1月时形态基本稳定。