LOx-1及细胞外HSP60在小胶质细胞介导的神经炎症及神经损伤中作用的研究

摘要

第一部分 LOX-1在小胶质细胞活化、神经炎症及神经损伤中作用的研究
　　机体的免疫应答是一把“双刃剑”，小胶质细胞过度活化介导的神经炎症参与众多中枢神经系统(CNS)病理进程。除外源性病原相关分子模式（PAMP）外，损伤组织细胞自身释放的损伤相关分子模式(DAMP)也具有免疫调节作用。
　　本研究采用反复冻融法构建神经元损伤细胞模型，收集损伤神经元条件培养基作为可溶性DAMP分子混合物;以此条件培养基处理大鼠小胶质细胞，评估可溶性DAMP分子的炎症刺激作用;利用体外神经元-小胶质细胞共培养体系，分析可溶性DAMP分子的神经毒性。我们发现:在初始损伤因素已去除情况下，损伤神经元释放的可溶性DAMP自身即可有效活化小胶质细胞，刺激小胶质细胞释放促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、一氧化氮(NO)、活性氧簇(ROS)，造成继发性神经损伤，形成“神经炎症-神经损伤”恶性循环。
　　凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)属C-型凝集素样受体家族及清道夫受体家族，可介导血管内皮炎症，参与动脉粥样硬化等病理进程，在CNS内功能不明。本研究以LPS刺激大鼠小胶质细胞，采用RT-PCR及Western blot法证实，小胶质细胞可表达LOX-1蛋白，其表达水平受LPS刺激而上调。为探讨LOX-1在DAMP介导的神经炎症及神经损伤进程中的作用，我们以RNA干扰技术下调小胶质细胞内LOX-1表达，重复上述小胶质细胞活化及神经毒性实验。我们发现:下调小胶质细胞内LOX-1表达，可减弱由DAMP引发的小胶质细胞活化，减少由DAMP引发的小胶质细胞促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、NO及ROS等炎性介质的释放，减轻由DAMP引发、小胶质细胞介导的继发性神经损伤。
　　综上所述，本研究明确了LOX-1为小胶质细胞表面重要的模式识别受体;在神经损伤进程中，LOX-1通过识别损伤神经元释放的可溶性DAMP，促进小胶质细胞活化，加重神经损伤，参与“神经炎症-神经损伤”恶性循环。
　　第二部分细胞外HSP60通过小胶质细胞表面受体LOX-1参与“神经炎症-神经损伤”恶性循环
　　小胶质细胞介导的“神经炎症-神经损伤”恶性循环参与众多中枢神经系统(CNS)神经退行性疾病病理进程;然而迄今为止，推动该循环的分子机制尚未完全阐明。
　　热休克蛋白60(HSP60)是一类高度保守且广泛表达的分子伴侣蛋白，主要参与调控蛋白质的折叠、转运、定位及降解。除细胞内的分子伴侣功能外，HSP60在某些应激情况下可被释放到细胞外，发挥免疫调节作用。细胞外HSP60在CNS内的功能尚不明了。本研究采用反复冻融法模拟神经元损伤，以Western blot法证实损伤神经细胞可向外界释放可溶性HSP60。为分析细胞外HSP60在CNS内的免疫调节作用，我们采用文献报道的真核过表达系统制备细胞外HSP60，并以此刺激小胶质细胞，进行小胶质细胞活化及神经毒性实验。结果发现:细胞外HSP60在CNS内发挥损伤相关分子模式（DAMP）样作用，可刺激小胶质细胞活化，促进小胶质细胞促炎细胞因子IL-1β的基因转录、一氧化氮(NO)的释放、活性氧簇（ROS）的生成，造成继发性神经损伤。
　　课题组前期研究发现，凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)为HSP60受体，可直接识别结合HSP60并促进树突状细胞对于HSP60偶联抗原的交叉提呈。第一部分结果显示，LOX-1为小胶质细胞表面重要的模式识别受体，参与DAMP触发的“神经炎症-神经损伤”恶性循环。为探讨细胞外HSP60与LOX-1的相互作用在神经炎症及神经损伤进程中的意义，我们以RNA干扰技术下调小胶质细胞内LOX-1表达，重复上述小胶质细胞活化及神经毒性实验。结果发现:下调小胶质细胞内LOX-1表达，可减弱由细胞外HSP60引发的小胶质细胞炎性介质（IL-1β、NO及ROS等）合成释放，减轻细胞外HSP60引发的小胶质细胞介导的继发性神经损伤。
　　综上所述，损伤神经细胞可释放可溶性HSP60;细胞外HSP60在CNS内发挥DMAP样作用;细胞外HSP60通过刺激小胶质细胞表面模式识别受体LOX-1，活化小胶质细胞，介导神经炎症，加重神经损伤，推动“神经炎症-神经损伤”恶性循环。
　　第三部分 DAMP与小胶质细胞介导的“神经炎症-神经损伤”恶性循环（综述）
　　进行性、不可逆性神经损伤为众多神经退行性疾病的共同病理特征，在初始损伤因素已去除的情况下，神经损伤仍可持续存在，分子机制不明。小胶质细胞为常驻中枢神经系统(central neural system，CNS)的巨噬细胞样固有免疫细胞。“静息”状态及适度活化的小胶质细胞可发挥重要的免疫防御、免疫监视作用，维持CNS内环境稳定。过度或者持续性活化的小胶质细胞则介导神经炎症，释放包括IL-1β、TNF-α、一氧化氮及活性氧簇等在内的炎症介质，导致继发性神经损伤。大量数据证实:小胶质细胞持续性活化介导的慢性神经炎症在神经退行性病理进程中扮演着重要的角色。然而，究竟何种机制维持了这种小胶质细胞的持续性活化，尚未完全明了。最近的研究表明，除细菌脂多糖等外源性病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)外，损伤神经细胞释放的内源性危险信号——损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)亦可刺激小胶质细胞，诱发CNS炎症反应。本文介绍了目前已知的与神经炎症相关的主要DAMP分子，分析了DAMP在小胶质细胞介导的“神经炎症-神经损伤”恶性循环中可能的作用，旨在以DAMP为切入点探讨慢性神经炎症、持续性神经损伤及神经退行性疾病的分子发病机制。

目录

摘要

第一部分 LOX-1在小胶质细胞活化、神经炎症及神经损伤中作用的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 细胞外HSP60通过小胶质细胞表面受体LOX-1参与“神经炎症-神经损伤”恶性循环

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 DAMP与小胶质细胞介导的“神经炎症-神经损伤”恶性循环(综述)

研究生期间参与撰写及发表的论文

致谢

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