NLRP3炎症体介导的小胶质细胞炎症反应在锰神经毒性中的作用

摘要

背景：
　　锰是人体所必须的微量元素。参与人体免疫反应，ATP的生成，骨骼生长等生理反应。此外，锰还可以作为机体许多酶的辅助因子，保障其发挥正常的生理作用。然而，当机体摄入过多的锰则会引起锰中毒的发生，其临床表现主要为类似帕金森氏病病症。中枢神经系统是锰作用人体的主要靶器官，黑质纹状体通路更是锰损伤神经系统的关键核团。形成了锰能够引起黑质纹状体内多巴胺能神经元功能减弱的经典理论。随着人们对锰神经毒性的进一步关注，锰对海马脑区调控的空间记忆能力损伤也渐渐被人们所证实。研究证实锰在大脑中的蓄积所造成的神经毒性作用与阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森症（Parkinson's disease，PD）、等多种神经退行性疾病都有着密切的关系。
　　在中枢神经系统中，小胶质细胞是免疫反应的关键细胞，主要来源于脑膜，脉络丛以及血管周围。其与巨噬细胞的功能相似，能通过一系列的模式识别受体（Pattern-Recognition Receptors, PRR）实时监测中枢神经系统的内环境。当组织受损或有害物质入侵的情况下，小胶质细胞发生活化反应，一方面发挥吞噬作用，一方面释放大量炎症因子，诱导外周固有免疫细胞及适应性免疫细胞迁移至受损或入侵部位，发挥免疫防御作用。因此，小胶质细胞活化及炎性因子释放在中枢神经系统的免疫应答防御反应中发挥了重要作用。小胶质细胞活化后能够快速诱导出多种炎性因子，其中包括白介素-1β（Interleukin-1 beta，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α）和IL-18等。本课题组以往研究发现，锰暴露能够诱导小胶质细胞活化，活化后释放的炎性因子可能是锰暴露导致神经元损伤的关键因素，研究结果为锰神经毒性机制阐明及锰中毒防护提供了重要线索。
　　炎症体是近年来炎性疾病领域关注的重点，在炎性因子成熟、释放过程中发挥重要作用。NLRP3炎症体是调控IL-1β、IL-18等炎性因子成熟释放的重要途径。在神经炎症中，小胶质细胞和巨噬细胞内的NLRP3炎症体能被β淀粉样蛋白（Amyloid-beta，Aβ），α-共核蛋白（α-synuclein，α-syn）所激活。活化的NLRP3发生寡聚化，募集接头蛋白ASC，通多CARD结构域与PYD结构域相互作用，进一步激活caspase-1，进而加工pro-IL-1β为成熟的IL-1β，并释放于细胞外发挥作用。
　　调控NLRP3炎症体活化成熟的因素很多，细胞内ROS的增多、K+浓度改变、ATP水平降低以及自噬等均能够影响NLRP3炎症体的活化。自噬是细胞维持内环境稳定重要的生理过程。自噬的形成过程包括自噬的启动、延伸、与溶酶体的融合和降解几个重要阶段。当自噬形成的某一过程受到抑制时则会导致自噬功能处于紊乱状态。研究表明，许多神经系统疾病的发生都与自噬功能的异常相关，PD、AD等均发现体内自噬降解过程异常。自噬与NLRP3炎症体之间的关系较为复杂，一方面当NLRP3炎症体处于激活状态时，则会促进自噬的发生；另一方面，自噬的过度活化则能够抑制 NLRP3炎症体的活化。许多研究表明，自噬的抑制能够活化 NLRP3炎症体，促进pro-IL-1β（36kDa）向成熟IL-1β转变。虽然自噬能够调控NLRP3炎症体的活化，但其具体机制至今尚未阐明，这也成为当今该领域研究的热点和难点。
　　目的：
　　研究锰暴露诱导的小胶质细胞活化及其释放的炎性因子在锰介导的学习记忆损伤中的作用；揭示NLRP3炎症体活化是锰诱导小胶质细胞活化释放炎性因子IL-1β和IL-18的关键环节；阐明自噬溶酶体功能紊乱与NLRP3炎症体活化之间的关系；揭示锰暴露诱导的自噬功能紊乱调控NLRP3炎症体活化的具体机制，为锰神经毒性的防护和治疗提供关键靶点和理论依据。
　　方法：
　　1．通过皮下注射氯化锰的方法，构建锰暴露的小鼠体内模型，采用原子荧光光谱法检测小鼠血锰和脑锰的浓度，运用恐惧条件箱以及电生理实验评估小鼠锰暴露后学习和记忆能力的改变；
　　2．通过免疫荧光化学法检测锰暴露后NLRP3炎症体在小鼠海马区以及BV2细胞（之后简称为BV2）中的表达改变。Western blot检测NLRP3炎症体相关蛋白NLRP3、cleaved caspase-1，炎性因子IL-1β的表达改变；
　　3．通过ELISA检测锰暴露后炎性因子IL-1β、IL-18和TNF-α的改变，以及qRT-PCR检测NLRP3和炎性因子IL-1β、IL-18mRNA水平的改变。
　　4．通过免疫荧光化学法检测自噬相关蛋白LC3的表达影响，Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3、p62、组织蛋白酶B（cathepsin B）蛋白的变化。透射电镜观察BV2自噬亚细胞结构的改变；，
　　5．分别运用Atg5 siRNA、Baf A1以及NH4Cl处理BV2，Western blot检测锰暴露后NLRP3炎症体相关蛋白NLRP3、cleaved caspase-1，炎性因子IL-1β的表达改变，ELISA检测锰暴露后炎性因子IL-1β、IL-18的改变。
　　结果：
　　1．皮下注射氯化锰7天后，小鼠血锰和脑锰与对照组相比明显升高，恐惧条件箱检测以及LTP实验发现锰暴露后能够引起小鼠学习记忆能力下降；
　　2．海马脑片以及BV2免疫荧光化学染色表明，锰暴露能够引起NLRP3炎症体表达增多。Western blot结果显示，体内外锰暴露均能够引起NLRP3炎症体相关蛋白NLRP3、cleaved caspase-1表达的增加；
　　3．ELISA实验检测发现锰暴露能够诱导炎性因子IL-1β、IL-18表达增加，并且在mRNA水平检测上也得以证实；
　　4．免疫细胞化学荧光染色结果提示，锰暴露可导致BV2内LC3标记的自噬体大量聚集。Western blot发现与对照组相比，锰暴露后自噬体相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3II、p62、组织蛋白酶Bbiao’da表达显著增加。p62升高提示锰暴露能够引起自噬溶酶体降解功能出现障碍。组织蛋白酶 B的表达增加以及电镜检测所发现的溶酶体形态异常提示锰暴露能够引起BV2溶酶体功能异常。
　　5．Atg5 siRNA和Baf A1分别抑制自噬体的启动、延伸和与溶酶体的融合后，并不能抑制锰暴露所诱导的NLRP3炎症体的活化及IL-1β、IL-18的释放。NH4Cl作用BV2后，Western blot检测发现其能够降低组织蛋白酶B的表达，抑制锰暴露所诱导的NLRP3炎症体的活化以及炎性因子IL-1β、IL-18的释放。
　　结论：
　　1．体内实验证实锰能够降低海马脑区所调控的学习和记忆能力。
　　2．锰暴露对学习记忆能力的影响可能与其所诱导的小胶质细胞活化后释放的促炎性因子（IL-1β和IL-18等）有关。
　　3．锰暴露激活NLRP3炎症体通路是其介导炎性因子释放的关键因素。
　　4．自噬溶酶体功能紊乱参与了锰诱导的NLRP3炎症体活化，自噬体启动、延伸及与溶酶体融合的异常不是调控NLRP3炎症体活化的重要环节.
　　5．锰暴露导致的溶酶体功能异常及cathepsin B的释放是引起NLRP3炎症体活化的关键因素。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、锰及其神经毒性研究进展

二、小胶质细胞活化与神经元的相互关系

三、小胶质细胞活化释放炎性因子的分子机制

四、炎症体在小胶质细胞释放炎性因子中的关键作用及其调控的分子信号通路

五、自噬在NLRP3介导的神经炎症中的可能作用

六、锰暴露促进小胶质细胞活化的可能机制及其生物学作用

实验一 锰暴露对小胶质细胞炎性因子释放及小鼠学习记忆的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 炎症体NLRP3的增多在锰诱导炎性因子释放中的作用

1 材料

2 方法

3. 结果

4 讨论

实验三 锰诱导的自噬溶酶体功能紊乱对 NLRP3炎症体的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢